利用SSR荧光标记鉴定玉米杂交种纯度的研究

尹祥佳 焦珍珍 赵慧军 李艳玫 贾国军 郝 楠 南 铭 李世风 张东峰

（1兰州职业技术学院，兰州730070；2北京通州国际种业科技有限公司，北京101100；3定西市农业科学研究院，甘肃定西743000；4甘肃省敦煌种业股份有限公司，酒泉735000）

玉米是第一个成功利用杂种优势的作物，也是利用杂种优势面积最大的作物[1]。2017年我国玉米播种面积3544.5万 hm²，总产量2158.9亿kg[2]，成为近10年来种植面积和产量增加最多、最快的农作物[3]，播种面积和产量均居我国四大作物之首。国内90%以上的玉米生产用种是单交种[4]，近年来国内玉米新品种种类较多，2017年就有国审玉米品种171个，国家完成统一试验程序的品种302个，联合体292个、绿色通道278个、引种备案玉米品种861个。因此，玉米种子作为我国种业的主导产品，杂交种质量好坏直接影响玉米大田生产、新品种市场规模及种子企业的经济效益[5]。

玉米种子的纯度是质量监管的重要指标之一。快速、标准的玉米种子质量检测方法是保护农民利益、维护育种家权益的重要措施[6]。传统的玉米种子纯度鉴定主要有形态鉴定、同工酶和贮藏蛋白质电泳技术，但由于多态性有限，随着玉米品种数量逐年增多，特别是大量近似品种的存在，难以做出有效鉴定[7]。DNA是生物遗传信息的直接载体，分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[8]。分子标记主要有限制性片段长度多态性（RFLPs）、随机扩增多态性（RAPDs）、扩增片段长度多态性（AFLPs）、单核苷酸多态性（SNP）和简单序列重复（SSRs）。简单序列重复具有技术简单、结果可靠、重复性好、共显性遗传、可区分杂合子和纯合子等众多优点在玉米种子纯度鉴定中有着广泛的应用[9]。目前，SSRs分析大多用PAGE胶分离银染检测，试验存在耗时、耗力、非自动化，不适用大规模、多批次的数据收集和分析等问题。SSR荧光标记技术因具有高效、精确、灵敏、自动化的优点，主要应用于玉米品种的遗传分析，但用于鉴定玉米杂交种纯度的文献报道很少[10-11]，因此，本研究利用SSR荧光标记技术对5个推广的玉米杂交种进行了纯度鉴定研究，研究结果可为SSR荧光标记快速鉴定玉米杂交种纯度提供参考依据，为逐步完善玉米纯度鉴定方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料金穗1203、金艾130、武科8号、方玉36和甘玉801共计5份玉米杂交种，购于甘肃省农科院农资市场。

1.2 SSR标记引物SSR标记引物参考《玉米品种鉴定DNA指纹方法》（NY/T 1432-2014），以及George 等[12]、Kahler等[13]、王凤格等[14]、吴金凤[15]和兰琴英等[16]报道的文献，SSR引物的5′端分别用NED、PET、FAM、VIC等进行荧光标记（Applied Biosystems，USA公司合成），20对核心引物信息见表1。

表1 20对引物信息

1.3 试验方法基因组DNA提取。采取改良的CTAB法提取基因组DNA：取种子发芽长出的新叶按顺序放到2mL 96深孔板中，加2颗3mm钢珠，将采集好的样品放到冻干机里进行冻干干燥20～24h后加 600μL CTAB，盖上硅胶盖，研磨 3min，取出看是否磨碎，根据情况可再研磨2～5min；将研磨好的深孔板放到离心机中，4000r/min离心2min；75℃烘箱放置30min，每10min轻轻摇动1次；冷却后，加600μL氯仿抽提，恒温振荡培养箱25℃，摇匀5min；4000r/min离心10min，取300μL上清液移至新的1.2mL 96深孔板；向上清液中加入0.7倍体积的冰异丙醇沉降DNA，加盖硅胶盖后放置-20℃条件下 15～30min；4000r/min离心10min，去上清，然后加入200μL 75%的乙醇，4000r/min离心10min，去上清后晾干；加入50μL ddH2O溶解。DNA质量和浓度用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度计进行测定，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，调节工作液浓度。

SSR荧光标记引物筛选。根据相关文献[17-18]报道的玉米群体遗传多样性研究的取样技术，采用每份样品随机选取15粒种子培养成单株取样组成一个混合样本的方法提取DNA作为引物筛选PCR扩增模板。从20对引物中随机选取10对核心引物。PCR 反应在 Veriti 96 well Thermalcycler（eppendorf）上进行。PCR 反应体系为 10μL，其中，DNA（50ng/μL）2μL，2xMix5.0 μL，Left primer（10μmol/L）0.1μL，Right primer（10μmol/L）0.1μL，ddH2O 2.8μL。PCR反应程序为95℃预变性10min，95℃变性20s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后72℃终延伸10min，4℃循环，复性温度根据不同引物进行调整。反应完后取PCR产物1μL，加入甲酰胺（HIDI）8.9μL，分子量内标 LIZ0.1μL混匀后在 PCR 仪上95℃变性 5min，于 4℃保存 10min，2000r/min 离心1min，用 ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析仪对PCR产物进行自动荧光检测。

SSR荧光标记纯度鉴定。每份杂交玉米种随机取96粒种子作为纯度鉴定样品，单独提取DNA，用筛选的具有多态性的2对荧光标记核心引物分别进行PCR反应，用ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析仪对 PCR 产物进行自动荧光检测。

数据分析统计。采用Data Collection v3.0软件整理数据，用Gene Marker 2.2.0软件确定分子量。将毛细管电泳检测所得的SSR扩增片段信息输入Microsoft Excel，计算玉米杂交种的纯度，公式为P（%）=（NT-ND）/NT×100，其中，P为种子纯度，NT为供检种子数，ND为杂交种子数。

2 结果与分析

2.1 DNA提取质量分析用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度计测定提取的玉米杂交种基因组DNA浓度，并调节浓度为50ng/μL，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测结果见图1，结果表明，提取的玉米基因组DNA主带清晰一致，适合进一步的SSR-PCR分析。

图1 玉米基因组DNA检测结果

2.2 SSR荧光标记引物筛选结果采用了15个单株混合取样的方法，随机选取引物P01、P03、P05、P08、P09、P11、P13、P16、P17、P20 等 10 对 SSR荧光标记引物分别对金穗1203、金艾130、武科8号、方玉36和甘玉801等5份玉米品种进行多态性引物筛选，筛选结果见图2～6。SSR荧光标记引物筛选的3个原则：一是具有双峰；二是峰值尽量单一、清晰；三是双峰的峰值差异不大。根据引物筛选原则，各筛选出了鉴定5份玉米品种纯度的2对SSR荧光标记引物，共筛选出了7对引物，分别为bnlg439w1、umc1705w1、umc2007y4、umc1506k12、bnlg2291k4、phi080k15、umc2015k3（表 2）。

图2 金穗1203玉米品种SSR引物筛选结果

图3 金艾130玉米品种SSR引物筛选结果

图4 武科8号玉米品种SSR引物筛选结果

图5 方玉36玉米品种SSR引物筛选结果

图6 甘玉801玉米品种SSR引物筛选结果

表2 鉴定5份玉米品种纯度的引物

2.3 SSR荧光标记纯度鉴定结果每份玉米品种随机选取96粒种子样品单独提取基因组DNA作为PCR扩增模板，根据筛选出的2对荧光标记引物进行了纯度鉴定，若鉴定结果峰图是双峰，且是引物筛选的峰值，则判断为是杂交种；若结果是双峰，但有一个位点是筛选的峰值，另一个位点是其他峰值，则判断为是异交种；若结果是双峰，但2个位点都不是引物筛选时的峰值，则判断为是杂株；若2个引物在该位点都是单峰，且峰值是引物筛选中的一个峰值，则判断为是自交种。鉴定部分结果见图7，纯度值在96.88%～98.44%之间（表3），达到了96%的玉米杂交种纯度国家标准。

3 结论与讨论

玉米中SSR多态性标记极为丰富，利用SSR分子标记技术可检测玉米染色体上不同位点的简单重复序列多态性，能够有效鉴定杂交种的纯度。玉米杂交种纯度鉴定需要用特异引物或引物组合来完成自交苗和异型株检测区分，因此，引物的筛选就显得尤为重要。朱盛安等[19]利用50对SSR引物对收集到的18个玉米杂交种及其亲本进行SSR标记分析，筛选了一套玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物。刘文彬等[20]分别用 Qiagen和ABI3730两种DNA分析仪，从111对新型玉米 SSR引物中筛选出多态性高、稳定性好、适于自动化分型的9对引物。冯博等[21]确定京科968玉米品种纯度鉴定的SSR荧光标记引物组合。本试验在20对SSR核心引物中分别筛选到了鉴定5个推广玉米品种的7对纯度鉴定引物，使用高分辨率的ABI3730xI DNA分析仪进行了纯度鉴定。选用4种荧光标记，根据峰值来判断引物相对扩增效率，且通量较高，数据分析简便。能够有效克服聚丙烯酰胺凝胶电泳带来的操作较为繁琐、耗时长、通量低、不适于大量引物的筛选鉴定问题。

图7 SSR荧光标记鉴定玉米品种纯度的部分结果

表3 玉米品种纯度鉴定结果

SSR荧光标记应用于鉴定玉米品种纯度，可以大大缩短种子纯度的检测时间，及时确定不同玉米品种种子质量，主要表现在3个方面：一是玉米种业企业可以准确快速检测玉米种子的纯度，保证种子的真实性，可以建立起玉米种业企业的制种质量监控体系，有效促进玉米田间制种技术规程的使用效果，严格做好去杂和去雄的工作；二是农业农村部植物新品种保护办公室在受理玉米新品种保护时，利用SSR荧光标记帮助做好DUS测试，给申请品种一个身份权利保护标识，加强玉米新品种保护的效力；三是在每年各级种子管理部门的种子市场执法检查时可以快速对种子纯度进行检测，以此来保护农户的权益，保障玉米生产安全。

本研究选用甘肃推广的金穗1203、金艾130、武科8号、方玉36和甘玉801等5个玉米杂交种，采用15个单株混合取样法提取DNA作为荧光标记引物筛选PCR扩增模板，筛选了7对SSR荧光标记引物并进行了纯度鉴定研究，结果表明，纯度值在96.88%～98.44%之间，达到了96%的玉米杂交种纯度国家标准。研究结果为应用ABI3730XL DNA分析仪快速鉴定玉米杂交种纯度提供了参考，同时为逐步完善玉米纯度鉴定方法奠定了基础。