食管癌切除附加抗反流术后残余食管黏膜上环氧化酶-2的表达

王金栋 朱守营 王峦 田春艳 陆源建

食管癌切除术后有60%～80%的患者出现胃食管反流的症状[1]。24小时食管pH值检测证实几乎所有患者术后出现胃食管反流[2]，而且在卧位时更加严重。长期反流可引起食管炎、Barrett食管以及再发食管癌[3]。为此，作者团队曾尝试一种抗反流吻合手术方式即食管癌切除附加改良Nissen折叠术，并证实其具有抗反流的效果[4]。

环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，参与组织细胞的调控，包括细胞增殖、血管发生以及抗细胞凋亡。有研究[5]发现食管黏膜上COX-2表达水平与食管远端酸暴露呈现正相关。在胃食管反流病的患者中，当实施Nissen折叠术后，食管黏膜上COX-2及白介素-8基因表达可恢复到正常水平[6,7]。基于这些发现，作者团队采用实时定量PCR法观察食管癌切除附加抗反流术后残余食管上COX-2表达水平的变化，从基因水平观察食管癌切除附加改良Nissen折叠术的抗反流效果。

对象与方法

一、 临床资料

1. 病例来源：收集2013年12月—2015年7月徐州医科大学附属徐州市立医院胸外科治疗的50例食管中下段癌患者，年龄51～73岁，平均59岁。①纳入标准：病例选择为食管中下段患者，吻合部位为食管胃弓上吻合。②排除标准：对于食管上段癌患者，因预留残余食管较短，难以附加改良Nissen折叠术，食管中段癌颈部吻合和食管下段癌行近端胃和弓下吻合病例均排除。

按照随机对照试验原则将50例患者分为抗反流吻合组和常规吻合组，常规吻合组实施食管癌切除食管胃常规吻合术，抗反流吻合组在实施常规吻合基础上附加改良Nissen折叠术。术后6个月～1年，42例患者参加术后随访，其中常规吻合组22例，抗反流吻合组20例。根据第8版食管鳞癌和食管腺癌国际TNM分期标准对患者进行分期。以10名无反流症状的健康志愿者作为对照组，其中男性8名，女2名；平均年龄45岁。本研究经医院伦理委员会批准。

二、 方法

1. 手术方法：两组患者均采用左胸后外侧切口，游离食管和胃，切除部分食管和胃食管连接部。常规吻合组吻合部位位于胃底顶部的大弯侧，食管胃端侧器械吻合(WH-Y-24，常州华森医疗器械有限公司)，吻合后食管肌层和胃浆肌层缝合4针加固吻合口(图1A)，胸腔胃缝缩呈胃管。抗反流吻合组吻合方式的示意图见图1B～D，充分游离食管及胃，切断处距游离食管上缘4～5 cm(器械吻合需切除长1～2 cm食管)，将胃底上提残余食管后方，吻合部位选择在胃前壁靠近胃大弯侧、胃底最高点下3～4 cm处，行食管胃端侧器械吻合(吻合器和常规吻合组相同)，将吻合口12点处胃底上提到残余食管后方(吻合口上2～3 cm)，在食管肌层和胃底浆肌层缝合一针，然后将上提的胃底牵向残余食管两侧，在残余食管3点和9点处(同样的高度)食管肌层和胃底浆肌层缝合两针，向前包绕吻合口和残余食管末2～3 cm和吻合口形成360°折叠。

图1 食管癌切除常规吻合和附加改良Nissen折叠术示意图。A：常规吻合；B～E：抗反流吻合

2. 胃镜检查：采用日本生产的OLYMPUS GIF-X0240电子胃镜。观察残余食管和吻合口黏膜的形态、色泽、舒张度和有无病变，并在吻合口上3 cm处残余食管黏膜上活检标本，分别在3、9、12点处各咬检一块。根据洛杉矶(LA)分类系统对反流性食管炎的严重程度进行分级和评分[8]：A 级，局限于1条食管黏膜皱襞上，黏膜破损长度≤ 5 cm(1 分)；B 级，局限于1条食管黏膜皱襞上，至少有1条黏膜长度>5 cm，但2条黏膜皱襞破损间无相互融合(2 分)；C 级，2条或2条以上黏膜破损存在相互融合，但未累及食管全周(3 分)；D 级，融合为全周性的黏膜破损(4 分)；正常食管黏膜记为 0 分。

3. real-time PCR检测：胃镜下咬取标本常规固定，按试剂盒(FFPET RNA Isolation Kit，Roche Applied Science Co.，Basel， Switzerland)的说明，提取目的RNA，用反转录cDNA试剂盒(Transcriptor first strand cDNA synthesis kit，Roche Applied Science Co.)合成cDNA。用ABI PRISM 7500型荧光定量PCR仪测定COX-2的表达，20 μl反应体系包括cDNA模板，1 200 nmol引物和200 nmol TaqMan探针(表1)，0.4 IU AmpiTaq Gold DNA聚合酶，3.5 mmol MgCl2，1×Taqman缓冲液，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；然后再95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共46个循环。应用real-time PCR平台计算COX-2的相对表达量。

三、 术后随访

术后随访内容包括胃食管反流症状问卷调查、胃镜检查、残余食管黏膜活检及活检标本COX-2的real-time PCR检测。

四、 统计学方法

结 果

一、 基线资料比较

按第8版食管鳞癌和食管腺癌国际TNM分期标准对肿瘤进行分期，经统计学分析显示，常规吻合组和抗反流吻合组患者在年龄、性别以及肿瘤发生的部位、组织学分型和TNM分期均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表1 COX-2、β-actin 引物和TaqMan探针

表2 常规吻合组和抗反流吻合组基线资料比较[n(%)]

二、 反流性食管炎的发生情况

胃镜检查显示两组均有不同程度的反流性食管炎(图2)，其中常规吻合组反流性食管炎的发病率为68.2%，抗反流吻合组发病率为45.0%，两组比较差异无统计学意义(χ2= 1.729，P= 1.313)；但抗反流吻合组中严重反流性食管炎(C、D级)明显少于常规吻合组，抗反流吻合组反流性食管炎评分明显低于常规吻合组[0.72±0.62)分vs(1.36±0.85)分，t=2.166，P=0.038]。

图2 常规吻合组和抗反流吻合组反流性食管炎发生率

三、 COX-2 mRNA的表达

Real-time PCR检测食管黏膜上COX-2基因表达水平，结果显示正常对照组COX-2 mRNA呈现低水平表达(0.062±0.039)，在两组中胃镜下检查残余食管黏膜正常的和残余食管黏膜上发生反流性食管炎的COX-2 mRNA表达水平分别为0.135±0.073和0.161±0.124，均高于正常对照组(P<0.05)；但两者间比较差异无统计学意义(P=0.137)(表3)。常规吻合组和抗反流吻合组COX-2 mRNA表达量均高于正常对照组(P=0.002和P=0.047)，而抗反流吻合组COX-2的表达量明显低于常规吻合组(P<0.05)，差异均有统计学意义(表4)。

讨 论

食管癌切除用胃重建消化道会引起胃内容物和十二指肠液反流至残余食管；此外，胸内负压和腹内正压的共同作用会促使反流物通过吻合口，因此食管癌术后胃食管反流是难以解决的问题，并且长期存在，不随时间延长而减轻[2]。常规吻合口无抗反流作用，许多外科医师尝试采用改进手术技巧和吻合方法减轻反流程度或防止反流发生。但有些手术虽然有效但操作复杂，未能得到广泛应用。

我们的手术方法是在食管胃器械吻合的基础上，将胃底部包绕吻合口和残余食管下端2～3 cm，试图在该部位建立高压带，阻止胃食管反流发生，手术过程容易操作。我们曾采用食管测压、24小时pH值监测、胃镜检查多项客观检查综合评价抗反流手术的效果。本研究结果表明，抗反流吻合组的胃食管反流程度明显低于常规吻合组，意味着食管癌切除附加Nissen折叠术有抗反流效果，并且在吻合口上方残余食管处出现高压带，起到类似食管下括约肌的作用，可能是减轻胃食管反流的原因[4]。

表3 残余食管黏膜上发生反流食管炎和黏膜正常组与正常对照组COX-2 mRNA表达量比较

注：①残余食管发生反流性食管炎组与正常对照组比较；②残余食管发生反流性食管炎组与残余食管黏膜正常组比较；③残余食管黏膜正常组与正常对照组比较

表4 常规吻合组、抗反流吻合组和正常对照组COX-2 mRNA表达量比较

注：①常规吻合组与正常对照组比较；②常规吻合组与抗反流吻合组比较；③抗反流吻合组与正常对照组比较

本研究通过胃镜观察两组患者术后残余食管的形态改变，评估术后反流性食管炎的发生率和严重程度。以往研究[9]显示，反流性食管炎的发生不仅与胃食管反流物的发生有关，而且反流物的性质、接触时间、食管酸清除能力以及唾液在清除和中和酸性等方面是引起反流性食管炎的重要因素并影响其严重程度。我们以前的研究也显示，酸反流(DeMeester评分)和十二指肠胃食管反流(胆红素abs>0.14 时间百分比)的严重程度与反流性食管炎的评分具有相关性[10]，也就是说反流性食管炎评分也能间接反映反流程度。本研究结果显示虽然抗反流吻合组反流性食管炎发生率和常规吻合组无明显差异，但反流性食管炎评分明显低于常规吻合组，而且严重反流性食管炎(C、D级)发生率明显低于常规吻合组，显示食管癌切除附加抗反流吻合术具有抗反流效果，降低了反流性食管炎的严重程度；但抗反流吻合组还存在不同程度的反流性食管炎发生，说明改良Nissen抗反流吻合还未完全防止反流的发生。最近的文献[11，12]报道，许多无症状的胃食管反流病患者或健康人群中，也存在非糜烂性食管炎，但胃镜不能观察到食管黏膜的损害，还需黏膜咬检病理下证实，因此，胃镜检查还存在一定的偏差。

24小时pH值监测是反应胃食管反流的“金标准”，我们以前通过24小时pH值监测也证实，食管癌附加改良Nissen折叠术具有抗反流效果，并试图通过检测基因表达的改变反应胃食管反流程度的变化。胃食管反流可以诱发食管黏膜上诸多基因的表达[13]，并且有些基因表达出现在食管黏膜损害之前，在应用抑酸药物后，表达水平明显下调，甚至下降至正常水平[14]，这意味着检测胃食管反流病患者食管黏膜上基因的表达可以作为反应胃食管反流发生的标志物。本研究采用real-time PCR方法检测残余食管黏膜上COX-2 mRNA的表达，发现食管癌术后(常规吻合组和抗反流吻合组)残余食管黏膜上有无发生反流性食管炎，以及COX-2 mRNA表达水平均明显高于正常人，但常规吻合组和抗反流吻合组无明显差别，意味着COX-2 mRNA表达上调发生在食管黏膜改变之前，能够预测胃食管反流的发生，可以作为提示反流发生的灵敏指标。

COX-2表达不仅与远端食管酸暴露呈正相关，并且胃食管反流病患者在实施Nissen折叠术后，可以使远端食管黏膜上COX-2 mRNA的高表达恢复到正常表达水平[5,6]。本研究结果显示，抗反流吻合组中残余食管黏膜上COX-2 mRNA的表达水平明显低于常规吻合组，表明胃食管反流程度的减轻可下调COX-2 mRNA的表达，COX-2 mRNA表达水平的降低可灵敏地反应食管癌切除附加改良Nissen折叠术的抗反流效果。虽然抗反流吻合组中残余食管黏膜上COX-2 mRNA的表达水平明显下降，但还未达到正常食管黏膜上的水平，预示这种抗反流手术不能完全阻止反流的发生。因此，监测食管黏膜COX-2 mRNA的表达可能会成为评估抗反流治疗的一种新手段，并可能为研究反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的发病机制提供新思路。

近年来，微创食管癌根治术已成为安全、可行的手术方式，并且与传统的手术方式相比患者术后并发症发生率低、恢复快和生活质量高[15]。食管代替物广泛采用管状胃(甚至细管胃)，文献[16,17]报道应用管状胃重建食管和全胃相比较术后反流性食管炎发生率明显降低，意味着管状胃重建能减轻胃食管反流的程度，其原因可能与下列因素有关，第一，管状胃缩小胃黏膜的面积使得胃酸分泌减少；第二，管状胃使胃容积减小、胃容受性扩张降低，进食时胃内压力增加有助于胃排空[18]。然而，部分食管癌切除胃代食管手术患者出现胰十二指肠胃食管反流(胆汁反流)，并且与反流性食管炎发生密切相关[19]。因此，微创食管癌手术是否在吻合口处附加抗反流手术将是以后探索和研究的方向。

综上所述，食管癌切除附加改良Nissen折叠术具有减轻胃食管反流的作用，检测残余食管黏膜上COX-2 mRNA的表达可能成为评估抗反流治疗的新方法。由于本研究病例数有限，在统计学上存在一定的偏差，仍需大宗病例和长时间术后随访进一步证实抗反流效果的有效性。