癌胚抗原相关黏附分子1对人支气管上皮细胞增殖、迁移及炎症因子的影响

程文栋 张娜

(青海省人民医院呼吸科，青海 西宁810007)

慢性阻塞性肺疾病(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD)常由细菌、病毒、环境污染物等诱发，并导致气道炎症及损伤。气道表面上皮细胞损伤后反应包括上皮细胞完整性的破坏、部分脱落，甚至是基底膜的完全脱落。随后上皮修复、再生并恢复功能，其机制涉及上皮基底细胞的迁移、上皮细胞的增殖与分化等。探讨支气管上皮细胞在AECOPD发生中的功能改变，对于AECOPD发病机制的研究十分重要。为研究CEACAM1对支气管上皮细胞功能的影响，本实验探讨CEACAM1对HBE细胞的增殖、迁移以及炎症因子产生等方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞系：人支气管上皮细胞株HBE来自中国科学院细胞库。主要试剂：IFN-γR&D Systems 公司；siRNA-CEACAM1GenePharma公司；siRNA-NCGenePharma公司；lipofectamin2000Invitrogen公司；Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco公司；RPMI-1640培养基Hyclone 公司；二甲亚讽(DMSO)Sigma公司；Trizol ReagentInvitrogen公司 ；DNase (RNase Free) water Invitrogen公司Sangon 公司 ；PrimeScript RT reagent KitTaKaRa公司；SYBR Premix Ex TaqTaKaRa公司；引物合成Sangon 公司；CCK-8试剂盒Beyotime 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 siRNA转染 HBE细胞 转染方法按Lipofectamine 2000产品说明书进行。转染前1天进行细胞铺板，将1×105个HBE细胞接种于24孔板(6孔板4×105个)，每孔内加入 500μl(6 孔板 2ml)无抗生素的 1640 培养基。Lipofectamine2000轻轻摇匀。按照每孔取1μl(6孔板4μl)Lipofectamine2000加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀释，轻轻混匀后，室温孵育5min。按照每孔2μl(6孔板8μl)siRNA加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀释，轻轻混匀后。5min后，将稀释的Lipofectamine2000 与稀释的 siRNA混合，轻轻混匀，室温静置20min，以形成siRNA-转染试剂混合物。将 siRNA-转染试剂混合液加入含细胞及培养液的孔内，轻轻摇晃孔板混匀。置于37℃、5%CO的培养箱中培养，6小时后更换为含血清的1640培养基。

1.2.2 Real-time PCR PCR检测引物如下：CEACAM1：Forward Primer：5’-GCTGGCATTGTGATTGGAGTA-3’；Reverse Primer：5’-TTAGGTGGGTCATTGGAGTG-3’；IL-6：Forward Primer：5’-GACAGCCACTCACCTCTTCAG-3’；Reverse Primer：5’-CATCCATCTTTTTCAGCCATC-3’；IL-8：Forward Primer：5’-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3’；Reverse Primer：5’-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3’；MCP-1：Forward Primer：5’-AGGAACCGAGAGGCTGAGA-3’；Reverse Primer：5’-GGAATGAAGGTGGCTGCTAT-3’；TGF-β：Forward Primer：5’-GCCAGAGTGGTTATCTTTTGATG-3’；Reverse Primer：5’-AGTGTGTTATCCCTGCTGTCAC-3’；VEGF：Forward Primer：5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’；Reverse Primer：5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’。具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行。

1.2.3 细胞划痕试验 HBE细胞培养于24孔板，转染 siRNA并用IFN-γ刺激24小时后，观察细胞达完全汇片。 用 10μl枪头比着直尺，每孔划出“+”字型两道划痕。 用PBS清洗细胞3次，尽量冲去划痕中漂浮的细胞。 加入无血清培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。分别于0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h于倒置显微镜下观察，并拍照。计算划痕面积，按以下公式计算划痕愈合度：愈合度=(S0-St) /S0×100%(S0：0时间点时的划痕面积；St：测定时间点时的划痕面积)。

1.2.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)测定细胞增殖 HBE细胞培养于 96孔板内，转染 siRNA，并分别于 IFN-γ 刺激 0h、24h、48h、72h进行检测。每孔内加入CCK-8 溶液 10μl。于37℃细胞培养箱内孵育1～2h。置于酶标仪，于450nm检测吸光度，吸光度与细胞数目呈线性相关。

1.3 统计学分析 统计软件用SPSS16.0，多组差别比较用单因素方差分析(One-way ANOVA test)，结果以±表示，两组间差别比较用Student’s t-test 检验进行，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ作用HBE细胞24小时后IL-6、IL-8、TGF-β、VEGF的表达 IFN-γ作用于HBE细胞24小时后进行Real-timePCR检测，发现IL-6及IL-8显著上调，而TGF-β与VEGF无显著变化。因此选择IL-6及IL-8进行下一步实验，见表1。

注：与HBE组相比，①P<0.05

2.2 siRNA干扰CEACAM1表达后IFN-γ作用HBE细胞24小时IL-6、IL-8的表达 用不同浓度IFN-γ刺激HBE细胞24小时，可见阴性参照(NC组)IL-6与IL-8的mRNA表达水平均有所升高。而siRNA干扰(CEACAM1组)的IL-6与IL-8表达水平与IFN-γ刺激无关，且与同等浓度IFN-γ刺激的NC组相比，其表达水平显著下降。提示IFN-γ诱导IL-6与IL-8表达有赖于CEACAM1的存在，见表2。

2.3 细胞划痕试验 转染siRNA-CEACAM1干扰CEACAM1表达后，与空白对照及siRNA-NC组相比，HBE细胞划痕愈合变慢。计算愈合度并绘制曲线发现，空白对照组与siRNA-NC组愈合度随时间变化增长幅度相近，而siRNA-CEACAM1组相比NC组及空白对照组，其愈合度明显较低。提示CEACAM1可促进HBE细胞的迁移，见表3，图1。

表2HBE细胞转染siRNA-CEACAM1后IFN-γ作用24小时IL-6、IL-8表达

Table2ExpressedbyIL-6andIL-8ofHBEcellstransfectedwithsiRNA-CEACAM1byIFN-γ

组别IL-6IL-8IFN-γ 0ng/ml NC组1.99±0.061.02±0.04 siRNA-CEACAM12.65±0.171.93±0.25IFN-γ 10ng/ml NC组5.98±0.24①②3.02±0.14①② siRNA-CEACAM12.24±0.181.89±0.12

注：与ong/ml NC组相比，①P<0.05；与0ng/ml IFN-γ相比，②P<0.05

表3 各组细胞划痕面积计算所得愈合度(×10-2)Table 3 The healing degree calculated with scratch area

注：与对照组相比，①P<0.05；与NC组相比，②P<0.05

图1 细胞划痕试验观察CEACAM1对HBE细胞迁移的影响(×40)Figure 1 Effect of CEACAM1 on migration of HBE cells

2.4 CCK-8试验测定CEACAM1对HBE细胞增殖的影响 转染siRNA-CEACAM1及NC组与空白对照组相比，细胞增长率明显减慢。而比较NC组与siRAN-CEACAM1组发现，在24小时时几乎无差异，但在48小时开始两组间差异明显(P<0.05)，siRNA-CEACAM1组细胞增长率较NC组显著减慢，因此认为siRNA-CEACAM1可减慢HBE细胞增殖，从而提示在IFN-γ环境下，CEACAM1可促进HBE细胞的增殖，见表4。

表4 CCK-8实验检测细胞增长率(×10-2)Table 4 CCK-8 test detected cell growth rate

注：与对照组相比，①P<0.05；与NC组相比，②P<0.05

3 讨论

COPD急性加重往往伴随着细菌、病毒等病原体的感染或环境污染物的吸入等所导致的气道炎症反应。以往的研究发现，在AECOPD患者的外周血及肺组织中，有多种炎症因子的水平发生显著变化[1-2]。其中白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-8(interleukin-8, IL-8)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等炎症因子，均被发现与AECOPD密切相关。

与稳定期COPD患者或健康人群相比，IL-6水平在AECOPD患者外周血及痰标本中均显著升高[3]，并且与COPD严重程度密切相关[4]。有研究发现，在病毒或流感嗜血杆菌感染的小鼠中，IL-6明显升高[5]。Jacques等在巨噬细胞中抑制CEACAM1表达后IL-6的水平无明显改变，因此提出IL-6的表达不依赖于CEACAM1[6]。而我们的研究发现，在HBE细胞中抑制CEACAM1后 IL-6表达水平较对照组明显降低，提示在HBE细胞中，IFN-γ通过诱导CEACAM1表达从而上调IL-6。

AECOPD患者中，血浆IL-8在内的趋化因子水平也有所升高[7]。有研究发现，在微血管内皮中CEACAM1过表达可导致IL-8的升高[8]。我们的研究发现，抑制CEACAM1的表达可阻断IFN-γ诱导的IL-8水平升高，提示IFN-γ是通过上调CEACAM1水平从而诱导IL-8的表达。VEGF在COPD患者外周血中的表达也有所升高[9]，尤其是在慢支型COPD患者中[10]。并且VEGF水平的升高与FEV1数值呈负相关，认为VEGF参与气道重塑[11]，而从急性期恢复后VEGF降低至稳定期水平[3]。有研究发现，在微血管内皮中CEACAM1过表达可导致VEGF的升高，并推测CEACAM1具有促进血管生成的作用[8]。TGF-β也被认为参与AECOPD的发生，TGF-β/smad 信号通路与COPD患者气道炎症及气道重塑的发生密切相关[12]。而在我们的研究中发现，IFN-γ作用HBE细胞后对VEGF或TGF-β无显著的调控作用，因此我们推测VEGF与TGF-β的表达不依赖IFN-γ的作用。

AECOPD的病理过程中，除了炎症因子水平的变化，还涉及气道表面的上皮细胞在损伤后的一系列反应，包括上皮细胞完整性的破坏、脱落以及损伤后修复、再生及功能重建。这一过程中涉及基底细胞的迁移、上皮细胞的增殖与分化等。在COPD患者气道上皮的损伤修复过程中，常常伴随气道上皮的重塑，例如鳞化、粘液腺增生等，从而很大程度上破坏气道上皮的固有免疫功能。在气道上皮损伤修复的再上皮化过程中，气道上皮细胞的迁移是首先发生的变化。有研究发现，在小鼠皮肤伤口愈合试验中，CEACAM1敲除小鼠的伤口愈合过程明显延长[13]，提示CEACAM1可促进皮肤细胞的迁移再生。我们在体外培养的HBE细胞中进行细胞划痕试验，发现应用siRNA干扰CEACAM1表达可显著延缓细胞划痕的愈合速度，提示CEACAM1可促进HBE细胞的迁移，从而促进上皮细胞损伤修复。

CEACAM1对细胞增殖的作用目前尚无统一的结论。在肿瘤中，CEACAM1对肿瘤增殖的作用取决于其L与S亚型的比例，不同CEACAM1亚型表现出对肿瘤生长截然不同的作用，CEACAM1-L亚型抑制肿瘤生长，而CEACAM1-S相反。在体外培养的细胞中，也同样发现CEACAM1对细胞增殖的作用与其亚型比例有关[14-18]。利用抗CEACAM1抗体阻断培养于含血清培养基中的膀胱癌细胞NBT-II 的CEACAM1表达，可刺激Erk 活化，降低p27表达，并诱导DNA合成；而在无血清培养基中则表现出相反的结果，提示CEACAM1对于持续暴露于生长因子环境下的细胞具有接触抑制作用，而对于缺乏生长因子的细胞则可共活化生长因子介导的细胞增殖[19-21]。在我们的研究中，采用siRNA干扰CEACAM1并应用IFN-γ刺激，检测HBE细胞的增殖情况，发现转染siRNA-CEACAM1抑制CEACAM1后HBE细胞增长率降低，提示CEACAM1具有促进HBE细胞增殖的作用。

4 结论

本文研究发现，IFN-γ可通过诱导CEACAM1表达而上调HBE细胞IL-6 及 IL-8等炎症因子的表达。提示CEACAM1可促进HBE细胞迁移及细胞增殖，因此，可能具有促进气道上皮损伤修复的功能。