焦磷酸测序鉴定建泽泻方法的建立

福建省医学科学研究院/福建省医学测试重点实验室，福建 福州 350001

泽泻为多年沼生泽泻科植物泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzep.的干燥块茎，最早历史记载可追溯到《神农本草经》。其性寒味甘，有泄热、利水渗湿、化浊降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。泽泻主产福建、四川、江西等地，素有“建泽泻”、“川泽泻”、“江泽泻”之称，以建泽泻、川泽泻量大且使用广泛，其中又以建泽泻质佳，被载入中国的道地药材。目前主要采用性状鉴别和化学成分分析对泽泻进行鉴定，该方法鉴定结果主观性较强，准确性无法得到保证。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing) 是一种基于酶催化反应的新一代测序技术，其精确性和可重复性高，并能够实时、直观地提供序列信息，同时能定性定量分析差异碱基。该技术利用生物素标记一条扩增引物，扩增产物无需荧光标记与电泳分离，因此操作更为简便、快捷。本实验采收福建省建瓯建泽泻药材，同时以川泽泻作为对照药材(采自四川省眉山)，采用焦磷酸测序方法鉴定其基源，为今后泽泻的质量控制研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 PCR仪(美国Bio-Rad)；高速离心机(德国eppendorf)；生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；超微量核酸/蛋白分析仪(英国Biochrom)；数显恒温水浴锅(江南仪器厂)；电泳仪(六一仪器厂)；暗箱式紫外投射仪(上海顾村电光仪器厂)；实时定量焦磷酸测序仪(凯杰生物工程有限公司)；恒温孵育器(德国eppendorf)。

1.2 材料 建泽泻药材采自福建省建瓯吉阳镇，川泽泻药材采自四川省眉山市彭山区谢家镇，经福建省医学科学研究院徐榕青研究员鉴定为泽泻科植物泽泻。分别取建泽泻与川泽泻的须根、叶柄及叶片样本。

1.3 试剂 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均购自凯杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix(AS111-14)购自北京全式金生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)购自美国BIOSHAPR；三羟甲基氨基甲烷、琼脂糖购自美国NOVON；其余试剂均为国产分析纯；实验引物由铂尚生物技术公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分别提取建泽泻、川泽泻的须根、叶柄及叶片DNA。

2.2 PCR扩增 25 μL PCR扩增体系中包含有1 μL DNA模板(约50～100 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，10 μmol/L上下游引物各1 μL(引物序列见表1)，用ddH2O补足至25 μL。扩增条件为94℃-5 min；(94℃-30 s，58℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃-5 min；扩增产物保存于4℃。

表1 引物序列

2.3 焦磷酸测序 取5 μL PCR产物、1 μL的beads、40 μL bingding buffer，补足MQ至80 μL，25℃1400rpm振荡孵育10 min。经变性和洗涤后，使未标记生物素的DNA单链与已标记单链分离，将含有beading的反应板于80℃孵育2 min后冷却至室温。试剂仓中加入所需的酶、底物和dNTP等进行检测。

2.4 测序验证 中药材DNA条形码鉴定系统中查询所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR扩增条件为94℃-5 min；(94℃-30 s，56℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃—10 min；扩增产物于4℃保存。未经纯化的PCR产物送铂尚生物技术有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 焦磷酸测序结果 采用焦磷酸测序技术进行SNP分析。根据ITS2位点突变情况，得两种峰图，建泽泻(含须根、叶柄、叶片)突变位点碱基为A(如图1所示)，川泽泻(含须根、叶柄、叶片)突变位点碱基为T(如图2所示)，二者突变频率均不小于83%(见表2)。

表2 样本的具体突变情况及频率

3.2 测序验证结果 测序序列与下载序列见表3，同时由图3可以看出，建泽泻ITS2序列与东方泽泻一致，与泽泻存在A-T突变；川泽泻ITS2序列与泽泻一致，与东方泽泻存在A-T突变。有研究表明东方泽泻与泽泻在ITS2序列上的A-T变异是稳定突变，因此可准确鉴定这两个物种[10]。故可判断建泽泻与东方泽泻基源一致，即Alismaorientalis(Sam.)Juzep.

表3 泽泻测序结果及下载序列信息表

4 讨论

实验采用焦磷酸测序技术对ITS2突变位点进行研究，发现建泽泻与川泽泻在突变位点碱基不同，且毛细管电泳测序技术进一步验证了这一结果，说明焦磷酸测序结果的准确性，因此本实验建立的基于ITS2突变位点的焦磷酸鉴定技术能准确鉴定不同产地的泽泻物种。与直接测序法相比，焦磷酸测序所用DNA不需要经过凝胶电泳纯化和荧光标记，测序过程中可对测序结果实时观察，同时能定性定量分析差异碱基，灵敏度高，操作便捷，适合已知序列的DNA短片段测序，是一种适用于中药材的分子生物学鉴定手段。