CD8阳性T细胞亚群在肺癌外周血的检测及分析

丁露,夏云红,王为民,姚荣杰,孟曼

(合肥市第二人民医院肿瘤内科，安徽 合肥 230000)

人体免疫功能与肺癌的发生、发展及转移有着相当密切的关系[1]，当人体出现免疫功能下降甚至免疫缺陷时，肿瘤发病率会明显增高。免疫衰老与T淋巴细胞表型及功能密切相关，当机体逐渐衰老时，初始型T细胞比例出现降低，而记忆型T细胞逐渐增加，其中以CD8+T细胞的改变较为明显[2]，而免疫衰老同某些恶性肿瘤发生相关，因此对CD8+T细胞亚群的检测具有十分重要的意义。本研究拟通过检测正常人群及肺癌患者外周血中CD8+CD57+T细胞水平的变化，评估其临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料采集2015年4月至2016年5月入住合肥市第二人民医院明确诊断为肺癌的初次治疗患者30例，其中男性患者21例，女性患者9例，年龄范围39～79岁，年龄(56.0±14.3)岁;TNM分期(UICC，第7版)Ⅲ期12例，Ⅳ期18例。病理类型腺癌15例，鳞癌8例，小细胞肺癌7例。所有患者均经细胞学或病理学证实。所有患者均经过全身化疗2周期后，以实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)评价疗效，按缓解组(完全缓解+部分缓解)和未缓解组(稳定+进展)进行分组，其中缓解组13例，未缓解组17例。健康对照组取自本院门诊体检健康者，共35例，其中男性19例，女性16例，年龄范围35～70岁，年龄(55.0±15.7)岁。所有入组患者及健康对照组人群均排除其他肿瘤、无风湿免疫性疾病，且未使用激素等免疫抑制剂。本研究获合肥市第二人民医院伦理委员会批准，所有患者或近亲属均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器采用CD8-PE、CD28-FITC、CD57-FITC单克隆抗体试剂购自美国Beckman-CouLter公司，流式细胞仪系美国Beckman-CouLter公司产品。

1.3检测方法分别采集肺癌患者周期性化疗前后及健康对照组清晨空腹静脉血2 mL，加入EDTA抗凝管后摇匀。取抗凝全血100 μL，各加入荧光标记单克隆抗体20 uL混匀，设相应同型对照。避光室温孵育30 min后，加入1%草酸铵2 mL，充分摇匀，孵育10 min；离心(1 500 r·min-1，10 min)弃去上清，每管加入PBS洗涤液500 μL后离心10 min(1 500转)，弃去上清，重复2次，加入100 μL PBS混匀后，应用流式细胞仪检测，采用BDFACSDiva软件分析获取细胞，样品于6 h内检测。

2 结果

2.1肺癌组患者血清中T细胞亚群表达与健康对照组的比较30例肺癌患者血清中CD8+CD28+T细胞表达水平低于健康对照组人群，而肺癌患者血清中CD8+CD57+T细胞表达水平显著高于健康对照组人群，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肺癌患者与健康对照组外周血T细胞亚群的表达水平

2.2经治疗后不同疗效的肺癌患者与健康对照组T细胞亚群水平的比较肺癌患者经含铂类药物为基础的两周期化疗后，缓解组患者血清中CD8+CD28+及CD8+CD57+T细胞水平与健康对照组相近，差异无统计学意义(P>0.05)，而未缓解组患者血清中CD8+CD28+及CD8+CD57+T细胞水平与健康对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同疗效肺癌患者与健康对照组外周血T细胞亚群表达水平

2.3不同病理学类型及临床分期肺癌患者T细胞亚群比较对于不同病理类型肺癌患者，其CD8+CD28+及CD8+CD57+T细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)，随着临床分期增加，CD8+CD57+T细胞表达程度亦差异无统计学意义(P>0.05)，而CD8+CD28+T细胞水平随之逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同病理类型及临床分期的肺癌患者T细胞亚群水平的检测结果

3 讨论

肿瘤的发生、侵袭过程中，承担自身免疫功能的淋巴细胞发挥了重要作用，是构成机体细胞免疫的重要因素之一[3]。反应免疫功能的细胞表型CD抗原是重要标志，并且会随着疾病的转归发生相应变化。机体对肿瘤细胞的免疫反应大多是由CD8+T细胞主导完成的。而肺癌患者细胞免疫功能的下降，常导致肺癌病情加重甚至死亡。

CD8+T细胞即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)，在宿主抗病毒和抗肿瘤等免疫应答中发挥重要作用。CD28分子是T细胞中最主要的共刺激分子，为T细胞活化提供第二信号，通常CD28在CTL表达水平约为50%，而当发生多种疾病时，CTL上CD28表达下降[4]。机体抗肿瘤免疫应答时，需CD28与B7相互作用产生第二信号才可使T细胞活化，活化的CD4+细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，由CD8+细胞毒性免疫细胞发挥直接杀伤，以防止形成克隆无反应状态。当CD28表达下降时，可能对CD4+及CD8+细胞的活化和增殖有着直接影响，因而造成机体对肿瘤免疫力下降，导致肿瘤的发生。有文献报道[5-7]CD8+CD28+T细胞表达水平在多种肿瘤中下降，张晓倩等[8]指出肺癌患者外周血中CD8+CD28+T细胞水平较健康对照组显著减少，因此CD28表达水平下降可能系肺癌患者免疫功能降低的重要因素。

CD57(leu-7)是人类NK细胞的标志，当其特异性结合靶细胞上的配体后，可以激活NK细胞的细胞毒作用。CD57也部分表达于T淋巴细胞，通常为CTL的表面，其与CTL的效应功能有关[9]。CD57是一种糖蛋白，其分子量为110kD，CD57+T细胞主要存在于骨髓，其在外周血中数量很少，为5%～10%。在骨髓和其他器官移植术后、类风湿性关节炎及AIDS患者，CD57+T细胞水平均增高[10]，提示该细胞在导致免疫异常的疾病中发挥一定作用。也有文献报道老年人CD8+CD57+T细胞明显高于青年人[11]，表明其在免疫衰老中有着一定意义，而肿瘤常发生于老年患者，因而肿瘤患者中可能出现CD8+CD57+T细胞表达水平的相应升高。有相关报道显示，CD57可以产生大量IFN-γ，且产生能力与数量相关[12]，而IFN-γ对肿瘤免疫发挥着重要作用。IFN-γ能够直接抑制肿瘤细胞增殖，增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子表达，抗肿瘤血管生成等。由此可见，CD8+T细胞表面CD57增多可能体现肺癌患者免疫功能下降。

本研究结果表明：肺癌患者CD8+T细胞表面CD28表达水平显著下降，而CD57较健康对照组明显升高，两组人群相比较CD28及CD57均差异有统计学意义(P<0.05)。通过两疗程化疗后，缓解组病情逐渐好转，与健康对照组比较差异无统计学意义，而未缓解组的患者CD28+T细胞和CD57+T细胞较健康对照组仍差异有统计学意义(P<0.05)。提示经化疗好转后，肺癌患者的免疫功能得到一定程度恢复，患者体内的肿瘤细胞数减少。本研究同时分析了临床因素与CD28和CD57的相关性，结果表明CD8+CD28+T细胞及CD8+CD57+T细胞的表达在肺癌患者不同组织学类型方面差异无统计学意义(P>0.05)，而随着临床分期的增加，CD8+CD57+T细胞表达率也未发现明显变化，究其原因，可能系本研究入组的为Ⅲ期和Ⅳ期中晚期肺癌患者，且多数为老年患者，临床分期和年龄选择不具代表性所致。而CD8+CD28+T细胞表达随着临床分期增加呈现逐渐升高，提示晚期肺癌患者免疫力降低，进一步表明CD28+T细胞增高水平可能与病情进展密切相关。研究结果表明该两组指标可能为肺癌免疫功能下降的原因，检测其表达可能评估肺癌患者疗效及预后。