藻蓝蛋白和松花粉的复合物对肠道微生物的影响

谢园园，秦松，石丽花，朱立猛，王桐，尹利端，李文军，*

（1.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台264003；2.烟台新时代健康产业有限公司，山东烟台264006）

藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）是一种存在于红藻和蓝藻细胞内的光合辅助色素，能高效捕获光能[1]。它既是一种蛋白质，又是一种极好的天然食用色素，同时又是良好的保健食品，亦可用于制药行业，具有抗肿瘤，抗炎，抗氧化等多种生物学功能，同时能够提高淋巴细胞活性，增强人体免疫力[2]。松花粉是我国传统的食药用佳品，含有近百种酶和多种活性氨基酸，且配比合理，有“微型营养库”之称[3]。服用松花粉，可以促进胃肠蠕动，增进食欲，帮助消化，对胃肠功能紊乱症有明显调节作用[4]。

人体消化道由动态和高度复杂的微生物群落组成。这些微生物主要由细菌组成，总数超过1014个细胞和数千个个体菌株[5]。肠道中的厌氧微生物种类超过1 000种，数量是人体细胞的10倍，其所包含的基因约是人体基因的100多倍，肠道已被认为是人体的一个重要的“微生物器官”[6-8]。肠道菌群在营养代谢，病原体抗性和免疫系统发育中起着至关重要的作用，肠道菌群失调会导致宿主疾病的发生[9]。研究表明高浓度蛋白质能促进肠道细菌的生长，相反，肠道中细菌可利用未消化的蛋白质，然后将这些膳食营养物质进行微生物发酵，产生代谢产物如短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），SCFAs作为结肠上皮细胞的燃料并诱导肠细胞增殖，对人体健康有益[10]。

正常情况下，人体肠道菌群的组成和结构相对稳定，然而，这种平衡在一定条件下会被打破，导致宿主疾病[11]。影响肠道菌群多样性的因素有很多，饮食、抗生素的使用基因型等均会对肠道菌群的多样性产生一定的影响[12]，而饮食是影响肠道菌群多样性的主要原因。藻蓝蛋白和松花粉均是常见的营养保健品，其中含有的蛋白和多糖等营养成分对肠道健康具有广泛的作用。因此，本文应用藻蓝蛋白和松花粉的复配产物，以C57BL/6小鼠为研究对象，探究藻蓝蛋白和松花粉的复配产物对肠道菌群的调节作用，为藻蓝蛋白和松花粉的应用提供更多基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

QIAamp DNA stool mini kit、凝胶提取试剂盒：Qiagen公司，德国；TruSeq DNA无PCR反应制备试剂盒：Illumina 公司，USA；PrimeScriptTMRT regent Kit、荧光定量PCR引物 SYBR Premix Ex Taq：TaKaRa。

藻蓝蛋白：福清市新大泽螺旋藻有限公司；破壁松花粉：烟台新时代健康产业有限公司。

ABI GeneAmp@9700 PCR系统：北京赛百奥科技有限公司；Qubit 2.0荧光计：Thermo Scientific公司。

1.2 实验动物及样本采集

6～8周龄，无特定病原体的雄性C57BL/6小鼠18只，均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，体重（20±2）g，所有动物均饲养于绿叶制药有限公司动物房，控制恒温（23±2）℃，恒湿（50%～60%），12 h/12 h的光照/黑暗循环，饲养期间自由摄食、摄水，实验开始前，所有动物均在此环境下适应性饲养一周。

小鼠适应性饲养一周后，随机分为2组（每组9只）：对照组（蒸馏水）、1.5 g/kg松花粉+50 mg/kg藻蓝蛋白组，通过灌胃的方式干预4周，对照组用相同体积的蒸馏水进行灌胃。

在实验开始前一天及实验结束时收集粪便样品，取样时，将小鼠单独放置在经过灭菌的笼子里，每只小鼠收集100 mg～150 mg新鲜的粪便于冻存管中，收集完将样品立即保存在-80℃冰箱中，用于检测16S rRNA V3和V4高变区肠道菌群的变化，并于实验结束后，腹腔注射200 mg/kg的戊巴比妥钠，将小鼠进行安乐死。

1.3 基因组DNA的提取

根据QIAamp DNA stool mini kit的说明书提取粪便样品的总基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上监测DNA浓度和纯度。根据浓度，用无菌水稀释DNA至1 ng/μL。

1.4 16S rRNA V3和V4区PCR扩增

选择16S rRNA的V3和V4高变区进行扩增，使用带 Barcode 的特异性引物：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’进行扩增。所有PCR反应均使用高保真PCR主混合物（New England Biolabs）进行。

1.5 PCR产物定量和鉴定

将等体积的1倍上样缓冲液与PCR产物混合，并在2%琼脂糖凝胶上电泳检测。在400 bp～450 bp之间选择带有明亮主带的样品用于进一步的实验。

1.6 PCR产物混合和纯化

PCR产物以等密度比混合。然后，用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化混合物PCR产物。

1.7 文库准备和测序

按照制造商的建议和索引代码，使用TruSeq DNA无PCR反应制备试剂盒产生测序文库。在Qubit 2.0荧光计和Agilent Bioanalyzer 2100系统上评估文库质量。最后，在IlluminaHiSeq2500平台上对文库进行测序，并产生250 bp的配对末端读数。

1.8 数据分析

为了使信息分析结果更准确可靠，首先对原始数据进行拼接，过滤，得到有效的数据。双链测序的片段经FLASH拼接，OTU聚类和物种分类以97%的相似度阈值进行分析。根据OTU聚类的结果，一方面用RDP分类器对每个OTU的代表序列进行注释，得到相应的物种信息和物种丰度分布。同时利用QIIME软件对序列进行分析，利用Perl语言和R语言软件对α和β的多样性进行分析，得到样本中物种丰富度和均匀度的信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息等。另一方面，基于UniFrac距离，采用主坐标分析对样本进行加权，并对样本进行聚类，以获得不同样本和群体的群落结构差异。

通过单因素方差分析（Tukey检验）来判断不同组之间的差异。上述统计分析采用SPSS19.0软件进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 α多样性分析

为了探究样本量是否充足及藻蓝蛋白松花粉复合物干预后肠道菌群丰富度和多样性的变化，进行了α多样性分析，如图1。

图1 α多样性分析Fig.1 Alpha-diversity analysis

基于Illumina Miseq平台的的16S rRNA的V3和V4高变区测序结果显示，通过过滤量控制和嵌合体去除后，获得了3 052 642个有效序列，有效序列的平均长度372。稀释性曲线是采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量对发现新OTU的边际贡献很小；反之则表明继续测序还可能产生较多新的OUT。测序结果表明，样品的稀释曲线（图1A）已进入平台期，达到饱和状态。说明在本实验的测序量下，测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。ACE是用来估计群落中含有OTU数目的指数，ACE值越大，说明群落物种越丰富，Shannon是用来估算样品中微生物的多样性指数，Shannon值越大，说明群落多样性越高。测序结果表明，藻蓝蛋白和松花粉复配组样品的ACE值（图1B）和Shannon值（图1C）均大于对照组，表明藻蓝蛋白和松花粉的复配产物可以促进肠道菌群的丰富度和多样性的增加。

2.2 门水平和科水平主要菌群的变化分析

为了分析肠道菌群的整体变化，对门水平相对丰度前七个的菌群和科水平相对丰度前十的菌群进行了比较，如图2所示。

采用16S rRNA的V3和V4高变区的高通量测序分析C57BL/6小鼠肠道菌群的组成，结果发现，在门水平（图 2A），Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria，Deferribacteres，Actinobacteria，Tenericutes和 Cyanobacteria是丰度最大的菌群，其中Bacteroidetes和Firmicutes是小鼠肠道里的两大主导菌群，其相对丰度维持在90%左右，Parkar等[13]在研究中指出拟杆菌门和厚壁菌门是参与代谢未消化食物的主要细菌群。与对照组相比，SPC组Bacteroidetes的相对丰度增加，而Firmicutes的相对丰度降低，其他菌群未发生显著变化。研究表明，拟杆菌门与厚壁菌门的比例与肥胖相关，肥胖患者中拟杆菌门与厚壁菌门的比值减小，在摄入藻蓝蛋白和松花粉的复配产品之后，与对照组相比，拟杆菌门与厚壁菌门的比值增加，表明藻蓝蛋白和松花粉的复配产品可能有助于减肥，然而小鼠的体重并未发生显著变化，可能是干预时间太短，体重并未发生显著变化[14-16]。在科水平（图2B），藻蓝蛋白和松花粉干预后，肠道菌群发生了显著变化。Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae，Lactobacilaceae，Erysipelotrichaceae，Helicobacteraceae，Prevotellaceae，Ruminococcaceae，Porphyromonadaceae，Bacteroidaceae和 Rikenellaceae是丰度最大的菌群，其中Bacteroidetes门中的Bacteroidales_S24-7_group和Firmicutes门中的Lachnospiraceae为主导菌群，其相对丰度大于60%。

图2 藻蓝蛋白和松花粉复配产物对小鼠肠道菌群组成的影响Fig.2 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota

2.3 科水平单菌变化分析

为了探究藻蓝蛋白和松花粉的复配物对对科水平小鼠肠道菌群组成的影响，对科水平的菌群进行了分析，如图3所示。

图3 藻蓝蛋白和松花粉的复配产物对科水平小鼠肠道菌群组成的影响Fig.3 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota at family

在科水平，藻蓝蛋白和松花粉干预4周后，小鼠的肠道菌群发生了显著变化。藻蓝蛋白和松花粉干预后，Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae 和 Ruminococcaceae的相对丰度显著增加，而Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group 和 Coriobacteri－aceae的相对丰度显著下降。Bacteroidales-S24-7-group是Bacteroidetes门中含量最高的细菌，在藻蓝蛋白和松花粉干预4周后相对丰度显著增加。Firmicutes门中的Ruminococcaceae在藻蓝蛋白和松花粉干预后，其相对丰度也显著增加。Bacteroidales-S24-7-group和Ruminococcaceae属于丁酸盐产生菌，丁酸盐在人体健康中起着重要作用，可直接为肠道上皮提供能量，改善肠道消化吸收营养，提高肠道免疫力[1-19]。藻蓝蛋白和松花粉干预后Firmicutes中的Lachnospiraceae相对丰度显著增加。有研究指出，Lachnospiraceae可用来预防人体结肠癌[20]。藻蓝蛋白和松花粉干预后Firmicutes门中的Clostridiaceae_1和Clostridiales_vadinBB60_group的相对丰度显著下降。Clostridiales_vadinBB60_group和Clostridiaceae_1都是梭状芽孢杆菌，有些梭状芽孢杆菌作为正常菌丛寄居在人或动物肠道内，部分梭菌对人或动物致病，它们大多产生强烈的外毒素，其中以破伤风梭菌和肉毒梭菌的毒力最强[21-22]。Actinobacteria门中的Coriobacteriaceae在藻蓝蛋白和松花粉干预后，相对丰度显著下降。Coriobacteriaceae是肠道中的正常菌群，有时也被认为是病态菌群，因为它们的出现与菌血症，牙周炎和阴道病等一系列病理学有关[23]。

2.4 主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）干预前后肠道菌群的变化

为进一步探讨藻蓝蛋白和松花粉的摄入对肠道微生物组成的影响，建立了主坐标分析（PCoA）图，见图4。

图4 藻蓝蛋白和松花粉干预后的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis after phycocyanin and pine pollen intervention

主坐标分析（PCoA）揭示了使用OTU在97%同一性阈值下的对照（CON）和藻蓝蛋白松花粉复配（SPC）组的明显聚类。主坐标分析图显示在藻蓝蛋白和松花粉干预之前，PCoA图显示小鼠的肠道微生物组彼此高度相似，而在藻蓝蛋白和松花粉干预4周后，肠道微生物组发生了明显的分离。这一结果表明藻蓝蛋白和松花粉可调节小鼠肠道微生物群的组成和多样性。

3 结论

通过灌胃藻蓝蛋白和松花粉的复配物，肠道菌群发生了显著变化。干预后，与对照组相比，藻蓝蛋白与松花粉复配组肠道菌群的丰富度和多样性显著增加。在门水平，Bacteroidetes的相对丰度增加，而Firmicutes的相对丰度降低。在科水平，藻蓝蛋白和松花粉的复配促进了有益菌（Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae）的定植，并降低条件致病菌（Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group和Coriobacteriaceae）的相对丰度，这些都有益于提高人体免疫力，并降低与条件致病菌相关疾病发生的风险，大大促进人体健康。因此，藻蓝蛋白和松花粉的复配产品，可以用以改善肠道菌群，提高免疫力，减少肠道相关疾病发生的风险，维持人体健康。