Box-Behnken响应面法优化康定鼠尾草中总黄酮的提取工艺

马志良

(藏药研发国家重点实验室，青海省藏医药研究院，西宁 810016)

康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)属唇形科(Labiatae)鼠尾草属(SalviaLinn.) 植物，产于四川西部和西北部、青海省南部等地区，早在几千年前该属种植物就成为重要的药用植物。唇形科鼠尾草属植物全世界有1 000种。我国有83种，青海有3种，大多数以根入药作丹参用[1]。其中青海省的3种分别为甘西鼠尾草、黏毛鼠尾草和康定鼠尾草[2]。鼠尾草主要含萜类、酚酸类和黄酮类等成分[3]。丹参是该属植物的代表药材，具有活血祛瘀、调经止痛和清热安神等功效[4]。研究表明，黄酮类化合物具有抗肝脏毒性、抗炎、抗免疫、抗肝纤维化、抗菌、抗病毒和解痉挛等作用[5-14]。本实验以康定鼠尾草茎叶为原料，对总黄酮进行超声提取[15]，提取过程研究了乙醇体积分数和液料比等对总黄酮得率的影响，在此基础上采用响应面分析法对主要因素进行优化，为大批量生产提供科学的参考依据[16-17]。

1 仪器与试药

1.1仪器 CRAY300紫外分光光度计(美国瓦里安公司)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器科技有限公司)；MOLELEMENT元素型超纯水机(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2试药 康定鼠尾草采自青海省玉树藏族自治州，经青海省藏医药研究院多杰研究员鉴定为唇形科植物康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)。芦丁(批号100080-201610)对照品，购自中国食品药品检定研究院，无水乙醇等均为国产市售分析纯。

2 实验方法

2.1芦丁最大吸收波长扫描和标准曲线 准确称取烘干至恒质量的芦丁对照品10 mg，用体积分数为70%的乙醇溶解，摇匀，定容至100 mL量瓶中，即得质量浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

取适量上述芦丁对照品溶液，采用紫外分光光度法在400～600 nm扫描，确定最大吸收波长。

分别精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL的上述芦丁对照品溶液，分别置于50 mL 量瓶中，滴加质量浓度为50 g·L-1的NaNO2溶液1 mL，再加入质量浓度为100 g·L-1的Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，反应6 min后加质量浓度为400 g·L-1的NaOH 1 mL。用体积分数为75%的乙醇稀释至刻度，显色15 min，以空白对照作为参比，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度值A。以吸光度值A和质量浓度C进行线性回归，并绘制芦丁标准曲线。

2.2总黄酮的含量测定 精密称定康定鼠尾草粉末0.5 g，加入一定量的体积分数为70%的乙醇，置于量瓶中，超声提取2次，合并2次滤液，用体积分数为70%的乙醇稀释至刻度。按照2.1项下方法测定总黄酮的含量。

2.3方法学考察 按照2.2项下含量测定方法进行提取实验，采用Al(NO3)3-NaNO2法[18]分别进行精密度、重复性、稳定性及回收率实验，对康定鼠尾草总黄酮进行方法学考察。

2.4单因素实验 按照2.2项下提取方法，先通过单因素实验选出对康定鼠尾草中总黄酮提取率具有显著影响的因素，确定其实验水平。分别考察不同乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取次数对康定鼠尾草中总黄酮提取率的影响。

2.5响应面优化实验 在单因素实验的基础上，选取超声时间、液料比和乙醇体积分数3个提取影响较显著的因素，根据Box-Behnken实验设计原理，以总黄酮提取率为响应值，采用经典的3因素3水平的响应面实验表，进行响应面实验，确定康定鼠尾草中总黄酮提取的最佳工艺[19-20]，实验因素和水平见表1。

表1Box-Behnken因素与水平

Tab.1 Factors and levels in Box-Behnken design

因素水平-101X1,超声时间/min304050X2,液料比8∶110∶112∶1X3,乙醇体积分数/%607080

3 结果

3.1芦丁对照品的最大吸收波长和标准曲线 采用CRAY300紫外分光光度计进行扫描，芦丁的最大吸收波长为510 nm。故在510 nm波长处测得芦丁的线性回归方程为：y=0.245 9x+0.035 9(r=0.999 8)，标准曲线线性关系良好。

3.2方法学考察

3.2.1精密度实验 称取6份康定鼠尾草样品，每份0.2 g，按照2.2项下方法进行提取实验，取6份滤液，分别测定吸光度值，计算RSD值为1.31%(n=6)，结果表明，仪器精密度良好。

3.2.2重复性实验 精密称取6份康定鼠尾草样品，每份0.2 g，按照2.2项下方法进行提取实验，分别测定吸光度值，计算总黄酮的平均含量为7.97%，RSD值为1.53%(n=6)，结果表明，重复性良好。

3.2.3稳定性实验 按照样品测定方法操作，测定同一供试品溶液在不同时间的吸光度值。结果表明，显色后30 min内吸光度值较稳定，随着时间的延长，样品吸光度值逐渐下降，故应在显色后30 min内进行测定。

3.2.4回收率实验 称取6份康定鼠尾草样品，每份0.1 g，按照2.2项下方法进行提取实验，分别加入芦丁对照品2.0 mg，制备供试品溶液，分别测定吸光度值，计算回收率。结果见表2。

表2总黄酮回收率

Tab.2 Recovery rates of flavonoids

(n=6)

3.3单因素实验结果

3.3.1提取时间对总黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为70%、液料比为10∶1条件下进行提取实验，考察提取时间与总黄酮得率之间的关系。根据Fick扩散定律确定在提取40 min 内总黄酮提取率呈上升趋势；达到一定的时间后会使扩散次数降低，总黄酮得率也随之降低，根据实验结果确定提取时间为40 min。

3.3.2液料比对总黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为70%、超声时间为40 min的条件下进行提取实验，考察液料比和总黄酮得率之间的关系。液料比在一定范围内，总黄酮得率随着液料比的增加而升高，当达到一定程度后，液料比对总黄酮得率无影响。根据实验结果确定液料比为10∶1。

3.3.3乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 在提取1次、超声50 min、液料比为10∶1的条件下进行提取实验，考察乙醇体积分数和总黄酮得率之间的关系。在乙醇体积分数小于70%时，总黄酮得率随着乙醇体积分数的增加而增大，当乙醇体积分数超过70%时，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率开始降低。根据实验结果确定乙醇体积分数为70%。

3.3.4提取次数对总黄酮得率的影响 在乙醇体积分数为70%、超声40 min、液料比10∶1的条件下进行提取实验，考察提取次数和总黄酮得率之间的关系。当提取2次时，总黄酮得率呈上升趋势，提取2次后总黄酮得率变化不大。根据实验结果确定提取次数为2次。

3.4响应面法分析康定鼠尾草总黄酮提取工艺

3.4.1响应面设计方案及响应值 从单因素实验结果可知，提取时间、液料比和乙醇体积分数对康定鼠尾草中总黄酮得率影响较显著，因此选取这3个因素作为影响因子，以总黄酮得率为响应值，Box-Behnken 设计方案所得的实验结果见表3。

经回归拟合后，得到以康定鼠尾草总黄酮得率为响应值的回归方程：总黄酮含量=-21.073+0.319X1+0.312X2+0.405X3-0.000 34X1X2+0.001 6X1X3-0.000 14X2X3-0.005X12-0.003X22-0.003 1X32。

由表4可知，提取时间与液料比的“Prob>F”值小于0.05，表明其具有明显的影响；乙醇体积分数的“Prob>F”值大于0.05，表明其对总黄酮得率影响不显著；整体模型的“Prob>F”值小于0.01，表明其具有明显的影响；失拟项比F为7.60，表明其无影响；决定系数为0.954 2，表明其变量之间有显著关系，该回归方程可用于总黄酮得率的预测。

表3Box-Behnken设计方案及响应值

Tab.3 Box-Behnken design proposal

编号超声时间/min液料比乙醇体积分数/%总黄酮得率/%14012∶1805.71124010∶1706.29434010∶1706.1324408∶1805.50155010∶1805.70163012∶1705.57174010∶1706.14684012∶1605.61495010∶1605.518104010∶1706.309113010∶1804.930125012∶1705.47413508∶1705.234143010∶1605.37415408∶1605.347164010∶1706.20217308∶1705.194

3.4.2响应面回归模型的方差分析 见表4。

表4回归方程方差分析

Tab.4 Analysis of variance of regression equation

参数自由度DF平方和SS均方MSFP(Prob>F)X110.0080.002 80.330.049 4X210.0010.002 10.250.046 7X310.000 970.000 970.120.983 0X1X210.000 000 40.000 000 40.000 0590.994 1X1X310.000 680.000 680.810.396 8X2X310.000 360.000 360.0420.842 5X1210.0580.0586.950.033 6X2210.0180.0182.210.180 9X3210.0250.0252.960.129 2模型90.1300.0148.660.002 2失误项30.0140.0147.600.039 6误差项40.0180.004 4总和160.180

3.4.3响应曲面结果分析 各因素对响应值的影响见图1。其中液料比的影响最为明显，最佳值为10∶1；另外，乙醇体积分数为70%、超声时间为40 min时最佳。

图1各提取因素之间的交互作用影响

Fig.1 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of polysaccharides

3.4.4总黄酮提取工艺条件的确定 根据实验研究选择最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数、液料比和超声时间分别为70.19%、10.94∶1和41.03 min，总黄酮得率可达6.24%。

4 讨论

本实验研究选择康定鼠尾草为原料，先通过Al(NO3)3-NaNO2法对康定鼠尾草中的总黄酮进行了方法学考察。其中精密度实验RSD值为1.31%，重复性实验RSD值为1.53%，在显色后30 min内较稳定，平均回收率为101.98%，RSD值为1.94%，结果表明，本方法精密度较高，重复性较好。

研究通过单因素实验选择了合适的提取工艺参数，并在此基础上开展了总黄酮的最佳超声提取工艺研究。实验结果表明，超声时间、液料比和乙醇体积分数对总黄酮得率有明显的影响，最佳参数为超声时间40 min、液料比10∶1、乙醇体积分数为70%，且该方法能够有效提高总黄酮得率，实验所采取的提取方法可用于更多方面的探索性研究，为鼠尾草的综合利用提供依据。