母血microRNA-520a水平与胎儿心脏缺陷关系的研究

李 源,阮 焱*,舒 畅

(1.首都医科大学附属北京妇产医院，北京100026;2.中国科学院基因组科学与信息重点实验室)

在2013年研究发现在母体中可以检测到来源于胎儿胎盘的RNA[1]。固有RNA的不稳定性，提示可以通过防止其在血清中降解从而使循环RNA达到稳定，甚至可以延长RNA在凋亡小体中暴露于核酶的时间[2]。这一重要发现使循环RNA分子应用于临床，也使得性别或基因型等可以用于无创性产前基因表达分析。另发现所有胎盘来源的mRNA在分娩之后就被快速清除，这一证据表明了该目标mRNA与妊娠过程相关[1]。miRNAs在胎盘中显著表达，其可能在持续的妊娠过程中与胎盘分化相关。且胎盘miRNAs可在母体血浆中被检测到[3]，这就提示其可做为新的胎儿核酸标记物，因此其可用于监控妊娠过程。

目前，用于妊娠早期胎儿心脏缺陷的诊断标志物及相关技术在准确性等方面仍然非常有限。因此，探寻有效、简便、快捷、高效而准确的可替代性无创循环或组织学指标来预测或诊断胎儿心脏缺陷的需求急为迫切[4]。本文旨在探讨母血中microRNA-520a水平与胎儿心脏缺陷的关系及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象与分组

收集2010年1月至2015年12月间于我院进行系统产前检查并超声心脏检查提示一处或多处先天性心脏缺陷胎儿的孕妇作为研究组，共44例；随机收集同期同孕周胎儿未发现异常的孕妇作为对照组共34例。两组的年龄为32.56±6.18岁，孕周为23.18±5.62周。全部参与者接收全程跟踪随访，随访结果满意。本研究经首都医科大学附属北京妇产医院医学研究伦理委员会批准。每位患者知情同意并签署书面知情同意书，全部患者均同意其病例数据及标本用于实验研究及论文发表。

1.2 标本采集

使用EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic acid) 抗凝管采集静脉血9 ml共两管，800×g离心后取上清。所得上清使用Eppendorf Centrifuge 5810 R 离心机(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)再次4,800×g于4℃下离心10 min。经过两次离心后，所获得的母体血浆上清标本使用Eppendorf 冻存管于-80℃保存以备进一步提取及分析miRNA 。

1.3 miRNA 提取

使用NucleoSpin○RmiRNA Plasma kit (Macherey-Nagel GmbH and Co.,KG,Düren,Germany)， 即血浆miRNA提取试剂盒提取miRNA，进一步采用Nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)检测仪测定总miRNA浓度。每个纯化后的标本测定使用吸光度值比率表示(吸光度值=A260/280)。

1.4 定量RT-PCR检测

在上述标本中加入3.5 μl合成miRNA-39 (cel-microRNA-39)，其来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)，用于跟踪标定对照，其工作浓度为1.6×108copies/μl。所提取miRNAs的定量和纯度测定分别使用Agilent 公司的Agilent 2100 Bioanalyzer 和RNA 6000 Nano/Pico LabChip进行相应检测。

进一步采取定量RT-PCR的方法标本中microRNA-520a的表达水平。为避免基因组DNA的污染及影响，首先采取如下措施以消除基因组DNA：(1)配制如下混合物--即5×gDNA Eraser缓冲液2.0 μl，1.0μl Gdna Eraser，然后加入微量总RNA后用RNase-free水补充至总量10.0 μl。(2)将前述混合物保持在42 ℃ 2 min，然后在4℃保存至进一步使用。(3)应用美国Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司的TaqMan microRNA逆转录试剂盒(4366596)将总RNA逆转录为cDNA，试剂体系为总量20.0 μl，其中包括上述去除基因组DNA的10.0 μl体系，另外再加入4.0 μl 5 × PrimeScript缓冲液，1.0 μl PrimeScript RTEnzyme混合物I，以及1.0 μl RT引物混合物，最后加入4.0 μl RNase-free水。(4)采取定量PCR方法使用PCR7900热循环仪(Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司)检测microRNA水平。各检测模板的目标序列如表1所示。

表1 各检测模板的目标序列

PCR反应体系总体积为20.0 μl，其中包括10.0 μl LightCycler 480 SYBR Green I混合物(德国，罗氏公司)，0.8 μl 正向PCR引物(10 μM)，0.8 μl反向PCR引物(10 μM)，1.0 μl cDNA模板(<100 ng)和7.4 μl RNase-free水。应用LightCycler 480(德国，罗氏公司)执行定量PCR检测，反应条件如下：在95℃下预变性5 min；95℃ 12 s，60℃ 8 s，72℃ 15秒为一个循环，共40个循环；溶解度曲线分析为95℃ 5 s、65℃ 60 s；最后在40℃下冷却30 s。每个反应进行6次。采用德国Bio-Rad公司CFX Manager Software v2.1 软件计算相对microRNA-520a表达水平，计算方法使用2-ΔΔCt法[5]。

1.5 统计分析

全部试验数据使用SPSS 18.0专用统计分析软件进行统计分析。独立样本t检验和单因素方差分析用于确定组间差异。数据以平均值(mean)±标准偏差(standard deviation，SD)形式表示。受试者工作特征曲线即ROC曲线是用来鉴别mirRNA-520a的预测能力。 所有P值采用双侧检验，P<0.05提示显著统计学差异。

2 结果

通过运用cel-microRNA-39的表达水平进行标准化后，结果显示研究组microRNA-520a的血浆表达水平较对照组显著升高(2.732±0.075)×10-2ng/ml vs (2.096±0.084)×10-2ng/ml；P<0.001，见图1。 ROC曲线下面积(AUC)结果为0.92 (95%可信区间为0.86-0.97；P<0.001) (见图2)。提示microRNA-520a在胎儿心脏缺陷儿的母体血浆中的表达水平显著升高。

Y轴单位为10-2 ng/ml

3 讨论

新的非侵入性检测生物标志物对早期诊断胎儿的遗传性疾病具有重大的临床价值，其可能显著改善早期诊断胎儿遗传性疾病的准确性。MicroRNAs已被诸多研究证实，其在人类的发育过程中起着至关重要的作用[6]。Lazar等研究发现，microRNAs与胎儿心脏发育密切相关[7]。

已有研究证实，microRNA-520/373是联系TGF-β和NF-κB通路之间的重要因素，其可能导致炎症、影响肿瘤的转移或进展过程[8]。miR-520-3p通过靶向MAP3K2，抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和转移，miR-520-3p在临床上可以作为非小细胞肺癌的预后标志物[9]。Mamczarz等证明过表达miR-520c-3p抑制细胞增殖及其全部基因的表达，从而调节DLBCL细胞的未成熟衰老过程，过表达miR-520c-3p可以抑制人类异种移植瘤在小鼠模型体内的生长过程[10]。

图2 ROC曲线下面积(AUC)分析

本研究microRNA-520a作为非侵入性诊断标志物在胎儿先天性心脏缺陷的临床诊断中的价值及意义。本研究中采用定量RT-PCR方法检测microRNA-520a在78例妊娠期母亲血浆中的表达水平，其中44例母亲分娩胎儿后随访发现心脏先天性缺陷，而对照组34例胎儿心脏状态正常。本结果提示，microRNA-520a在先天性心脏缺陷患儿母亲血浆中的表达水平与正常对照组相比显著上升 (P<0.001)，ROC特征曲线下面积(AUC)为0.92 (95%可信区间为0.86-0.97；P<0.001)。研究提示，microRNA-520a的血浆表达水平与胎儿心脏缺陷存在一定的关系。因此，本研究提示microRNA-520a有可能作为组合性miRNA评估指标之一，母血microRNA-520a表达水平可能作为妊娠期胎儿的先天性心脏缺陷的非侵入性辅助诊断标志物，用于妊娠期胎儿的先天性心脏缺陷的早期筛查与评估。

在胚胎发育的过程中，心脏发育属于其中一部分且是一个极为复杂的过程，与细胞多种生物学过程相关，包括细胞迁移、细胞黏附以及细胞周期等过程。心脏发育也涉及了多种理化过程，因此也受到相关因素的影响与调控。心脏的发育过程中，各种信号转导通路及其相关的关键通路蛋白及调控因子均参与其中，也包括多种生长因子和转录因子[11]。而miRNAs作为转录后调控的关键因素之一，其虽为非编码RNA,但可通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区起到直接使靶基因的mRNA降解或使之翻译过程受到显著抑制而发挥其细胞生物学功能。miRNAs广泛参与的细胞生物学过程，对心脏发育也至关重要[12，13]。

在本研究中，本课题组首次通过一定样本量的实验研究了母血microRNA-520a水平与胎儿心脏缺陷的关系，为临床筛查与诊断胎儿心脏出生缺陷提供新的辅助指标。