我国华北区甜菜苗期未知叶斑病害的诊断鉴定

李文兵，白进玲，王 颖，张宗英，吴学宏，韩成贵

（中国农业大学植物病理学系，北京100193）

甜菜苗期主要病害是立枯病[1]。2014年4月底5月初，我国河北省和内蒙古两地大面积甜菜种植区苗期甜菜叶片上出现一种新的叶部枯斑病害，症状为子叶和真叶上出现枯斑，中心黄白色，有紫色晕圈，一般在育苗棚滴水处形成发病中心（如图1）。河北省张家口地区张北糖厂纸筒育苗面积14万亩（9330 hm2）中约2万亩（1330 hm2）发生此病害，内蒙古集宁地区商都、察右前旗和赤峰地区林西等地也均有发生。该未知的苗期病害会给甜菜的生产造成较大的经济损失。糖厂技术人员认为是苗期褐斑病，笔者初步认为是真菌病害但不一定是褐斑病菌所致。因此，有必要通过室内柯赫氏法则试验尽早诊断出该未知病害及鉴定其病原，为有效控制此类病害、减轻甜菜损失提供理论指导。

图1 苗期甜菜未知叶斑病害叶片症状

1 材料与方法

1.1 材料

供试甜菜：采自内蒙古林西地区和河北省张北县地区未知病害的苗期甜菜。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），用于病原菌的分离、培养、保存[2]。

1.2 方法

1.2.1 未知病原分离与保存及病原鉴定 在采自我国不同地点甜菜病叶的病健交界处取5 mm×5 mm的病组织，3%次氯酸钠消毒3～5 min，无菌水冲洗3次后晾干接种在PDA培养基上，25℃黑暗培养并纯化，将纯化后的病原物置于4℃冰箱中保存备用。主要依据形态和分子序列进行鉴定。DNA提取、PCR扩增、产物回收、连接、转化和测序等参照林杰等方法[2-6]。

1.2.2 接种实验 采用无伤接种的叶片涂抹法进行致病性试验，供试甜菜品种甜研309。方法如下：1）每株菌需要品种为甜研309健康生长3～4周的叶片15片，置于发芽盒中（每盒5片叶子），事先在发芽盒内垫上合适大小的灭菌滤纸，并喷洒足量灭菌水用于保湿；2）在每个叶片上下两端均接种20μL浓度为106个/mL孢子悬浮液（接种处要远离叶脉），同时设置无菌水处理的叶片作为对照；3）接种完毕用保鲜膜将发芽盒封好，再放入25℃培养箱内培养，7 d后观察叶片的发病情况并统计结果[2]。

2 试验结果与分析

2.1 直接提取甜菜病叶DNA进行PCR检测结果

分别提取甜菜病叶DNA直接PCR检测结果，检测结果表明甜菜褐斑病菌的特异引物不能扩增出特异条带，而用真菌检测通用ITS引物可以扩增出目标条带（图2）。基于此检测结果可知：该苗期病害并非甜菜褐斑病，可以初步确定是一种真菌病害。

2.2 病原菌分离结果

取甜菜病健交界处组织进行分离，并逐步纯化获得纯培养物（3次重复以上），5个分离物（林西、张北）在PDA培养基上菌落形态菌呈灰色毛绒状均匀分布（图3和4）。

图2 不同引物PCR检测病样品结果

图3 林西病样分离的病原菌菌落正反面

图4 张北病样分离的病原菌菌落正反面

2.3 提取分离菌株菌丝的DNA检测结果

2.3.1 利用真菌检测通用引物ITS1及ITS4的检测结果 刮取上述5个分离物（L1、L2、Z1、Z2、Z3）菌丝提取DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4检测，PCR检测结果得到一条长541 bp单一条带（图5）。

经过对5个分离物扩增产物分别连接转化，各挑取8个克隆，测序结果比对序列相同。NCBI比对结果为：无论是直接提取病叶DNA测序还是分离的病原菌提取菌落DNA测序得到的序列相同，比对结果为Alternaria tenuissima（极细链格孢菌）。

2.3.2 利用H3-1a/H3-1b引物检测 利用组蛋白3基因部分编码区保守序列设计的引物H3-1a和H3-1b扩增分离物菌丝DNA结果得到一条600 bp左右单一条带。对照为一株已经鉴定的链格孢菌。回收测序结果同真菌通用引物检测结果一致，均为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima），见图6。

图5 真菌通用引物ITS1及ITS4 PCR检测分离菌株结果L：代表内蒙林西分离物；Z：代表河北张北分离物

图6 H3-1a/H3-1b引物PCR检测结果

2.4 分离物回接试验结果

根据柯赫氏法则，将分离得到的病原物回接到苗期甜菜叶片上，出现了相同的症状，接种成功率为100%，实验重复3次，结果一致，表明分离的菌株确实是引起这种病害的病原物（图7）。将回接成功的甜菜病叶，取病健交界处组织进行分离、鉴定，同样再次获得了该病原菌，完成了柯赫氏法则全部试验（图8）。

图7 病原菌回接甜菜（品种为甜研309）

图8 从接种发病叶片再分离病原菌

3 结论与讨论

通过对张北和林西甜菜苗期发生未知叶部病害样品进行病叶提取DNA直接PCR检测、病原菌分离、鉴定和回接试验，进行了准确诊断和鉴定。提取甜菜苗期叶部病害样和分离的病原菌株菌丝DNA，利用真菌检测的通用引物ITS1及ITS4和根据组蛋白3基因部分编码区保守序列设计的H3-1a和H3-1b引物检测结果得到一条单一条带，测定序列，NCBI比对结果表明，无论是直接提取病叶DNA测序还是分离的病原菌提取菌落DNA测序得到的序列相同，结合分离菌落形态，对该病害的病原菌进行了准确鉴定，同时进行病原菌回接实验证明确实能引起甜菜苗期叶斑病害。首次明确了这种甜菜苗期出现的未知叶斑病害为一种真菌病害，其病原为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima），排除了褐斑病菌危害的可能性，解决了生产中的难题，为今后再出现此种病害的诊断和寻求有效控制措施提供了理论依据和技术支持。

极细链格孢菌是一种重要的植物病原真菌，其对环境适应能力强，寄主范围广泛[7]，不仅能侵染柚、柑橘、杏、葡萄、脐橙、柠檬、草莓等水果，还可在花生、小麦、向日葵、棉花、大豆、辣椒、豇豆及绿穗苋等多种植物上寄生，给农业生产造成巨大损失[8]。2014年黑龙江大学在红柴胡（一种杂草）上报道过极细链格孢菌类似序列。由于我们采集的样品有限，因此，不排除有其他链格饱菌种类可以引起此病的可能性。

我们在调查时初步诊断为真菌病害，并给出了初步防治建议。对于发生较重的苗床可以用防治褐斑病的广谱性药剂苯醚甲环唑和氟硅唑等进行喷药控制。如果苗源紧张，新叶和根发育正常的苗子可以移栽。极细链格孢菌通过我们的准确诊断和病原鉴定，可以更有针对性地进行病害发生分布、发生因素分析和有效控制技术研发。

致谢：博天糖业股份有限公司张海和高鸿斌先生，荷兰安地公司北京代表处的秦树才先生等协助采集甜菜样品；内蒙古农牧业科学院张惠忠研究员提供甜菜品种。