正交试验法优化芹菜叶中绿原酸的提取工艺

尚朝利 夏小婧

【摘 要】 目的：优化芹菜叶中绿原酸的提取工艺。方法：采用超声波法对芹菜叶中绿原酸进行提取，并进行正交实验优化提取工艺，以绿原酸的提取率为评价指标，用高效液相色谱法进行测定含量。结果：在功率300 W条件下，超声40 min，用10倍量的75%乙醇作为溶媒提取3次为最佳工艺条件。结论：采用超声提取工艺，能提高芹菜叶中绿原酸的提取效率，实验方法简单易行，操作稳定性好，具有良好的应用前景。

【关键词】 超声波提取；芹菜；绿原酸；正交实验

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）06-0025-03

芹菜为伞形科多年生草本植物芹菜（Apium graveolens L.）的带根全草，味甘、辛、微苦，性凉[1]。《本草纲目》记载：“旱芹，其性滑利”。芹菜在我国已有2000年的种植历史，培育出了旱芹、水芹、西芹等多个亚种，其中以旱芹的药用功效最好，是我国传统的药食两用的中药材，具有安神、利尿消肿、平肝降压、养血补虚、清热解毒、防癌抗癌、醒酒养胃等药用功效，同时还具有减肥、美白的功效[1]。目前从金银花、菊花、杜仲叶、山楂等中提取绿原酸的方法已有报道[2-5]，但是从芹菜中的提取分离绿原酸尚未见有报道。超声波辅助提取的方法，有利于提高溶剂提取法的效率，缩短提取时间，减少溶剂用量，节能环保等[6]。笔者研究芹菜叶中绿原酸的提取工艺，以期为芹菜的综合开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 GVT-15L功率可调式超声波清洗机（深圳市够威科技有限公司）；LC-20AB高效液相色谱仪（含SPD-M20A PDA紫外检测器，日本岛津）。

1.2 材料 绿原酸对照品（批号：110753-201610，中国食品药品检定研究院，纯度：>98.0%），芹菜叶（购于信阳市浉河区化工路丹尼斯，经信阳职业技术学院吴长忠副教授鉴定为伞形科草本植物芹菜（Apium graveolens L.）的叶，60 ℃减压干燥至恒重）。甲醇（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），乙醇（分析纯，郑州晟弘工贸有限公司）。

2 方法与结果

2.1 绿原酸的含量测定

2.1.1 吸收波长的选择 以甲醇为空白对照，用30μg/mL的绿原酸对照品甲醇溶液，在200～450 nm波长范围内进行扫描，发现绿原酸在328 nm波长处有最大吸收，根据文献[7]报道，芹菜中绿原酸的含量相对较低，为了提高检测的灵敏度，选择在绿原酸的最大吸收波长处测定其含量。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Luna C18 ODS柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（30∶70）；检测波长：328 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量10 μL。按照上述条件各组分分离度良好。采用外标法测定绿原酸的含量。

2.1.3 方法学验证 根据文献[7-9]的实验方法制备标准曲线、验证回收率、精密度、稳定性、重复性等，进行方法学考察。经过实验得标准曲线为：Y=1.2×105X+8152.3（r=0.9998），说明进样量在0.01～1.00 μg范围内与峰面积成良好的线形关系；加样回收率分别为98.91%、99.42%、99.13%，RSD分别为1.92%、1.86%、1.75% （n=3），表明该方法准确定良好；连续进样6次，绿原酸峰面积的RSD为0.48%（<3%），说明仪器精密度良好；稳定性试验说明24 h内绿原酸供试品溶液稳定性良好。

2.2 提取溶剂的选择 绿原酸可溶于热水，易溶于乙醇和丙酮。考虑到成本和毒性的原因，选用纯化水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇作为溶剂，按照“2.4.2 制备工艺”项下方法，进行单因素试验考察溶剂对绿原酸提取的影响，并按“2.1含量测定”项下的方法，测定提取液中绿原酸的含量。结果见表1。

由上表可知，以75%乙醇作為提取溶剂时，绿原酸的提取率比较高，因此采用75%乙醇作为提取溶剂。

2.3 提取次数的选择 选用75%乙醇作为提取溶剂，按照“2.4.2 制备工艺”项下方法，进行单因素试验考察提取次数对绿原酸的累积提取量的影响，并按“2.1含量测定”项下的方法，测定提取液中绿原酸的含量。结果见图1。

由上图可知，当提取次数超过3次时，累积提取量的增加已经非常缓慢，而且第3次的累积提取量已经达到六次的总累积提取量的97.3%。因此，为了简化浓缩等后处理的需要，选用提取3次。

2.4 超声波样品提取液的制备

2.4.1 工艺设计 选用L9（34）正交实验，参考有关文献，选取表2中四个因素设计正交试验因素水平。结果见表2、表3。

2.4.2 制备工艺 取干燥至恒重的芹菜叶10.0 g精密称定，用提取溶剂浸泡30 min超声提取3次，合并提取液，滤过，浓缩，用甲醇稀释到适宜的浓度，得到超声样品[5-6]。

2.5 样品含量测定 将L9（34）正交试验的提取液按“2.1项下含量测定法”进行测定。由表3、4可知，超声波的功率和超声提取的时间是影响超声提取的主要因素（P<0.05），而其他两个因素的影响较小。最佳方案的为：A1B3C2D3，即在功率300 W条件下，超声40 min，用10倍的用量的75%乙醇作为溶媒提取3次为最佳工艺条件。

2.6 验证实验 采用优化后的超声提取法，提取芹菜叶中的绿原酸。提取结果为1.43 mg/g、1.39 mg/g、1.42 mg/g、1.41 mg/g、1.45 mg/g和1.38 mg/g，RSD为1.83%。由此可知，优化后的超声提取法提取芹菜叶中的绿原酸，提取效率高，实验方法简单易行，操作稳定性好。

3 讨论

绿原酸是植物的次生代谢产物之一，具抗氧化、抗菌、抗病毒、保肝利膽、解痉和抗诱变等多种药理活性[10]。由于绿原酸分子内含有邻二酚羟基和双键等易氧化的基团，并含有酯键等易水解的基团，导致其化学性质不稳定，具有还原性，易被氧化，同时也不耐高温，高温时容易分解失效。因此本实验采用可以密闭提取的超声波提取法，以提高绿原酸的提取率，减少提取过程中温度和氧气对绿原酸的破坏作用。

芹菜叶主要含有蛋白质、纤维素、碳水化合物、维生素、微量元素等对人体有益的物质，同时还含有黄酮、多糖、绿原酸等具有药理活性的化合物，具有降压、消肿、抗癌、安神、止血、健胃和补虚等临床应用。本研究为芹菜在食品和药品领域的进一步开发奠定了一定的基础。

参考文献

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[2]赵正荣，孟建国，邵易珊，等.金银花中绿原酸提取工艺的实验研究[J].陕西中医药大学学报，2017，40（5）：82-84.

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