EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物 离子吸收和分配的影响

王小山，季晓敏，刘隆阳，纪冰沁，田银芳

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.扬州大学实验农牧场，江苏 扬州 225009)

全球具有开垦价值的土地面积为7×109hm2，其中已开垦的土地面积仅为1.5×109hm2[1]，而盐碱地面积为9.55×108hm2[2]。再纵观我国现状，盐渍化土地面积约为109hm2，而耕地中盐渍化面积约为9.21×106hm2，占全国耕地总面积的6.6%。江苏省的盐渍化土壤多在沿海城市，一般被称作江苏海岸带，由于地质作用形成滩涂，每年以1300 hm2左右的速度向外扩展[3]。由于盐渍化土壤具有含盐量高、通气性差、营养成分低的特性，故这种土质不适合绝大多数植物生存，因此研究植物在盐胁迫下重要离子的分配情况对选育耐盐品种和管理土壤盐渍化具有重要意义。

苜蓿因其营养丰富，在世界上广泛种植，而且由于其发达的根系，还具有防风固沙及保持水土等重要的生态功能[4-5]。此外，苜蓿在遭遇盐胁迫时，可以通过叶片排出盐分，是改良盐碱地的理想材料[6]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)享有“牧草之王”的美誉，在世界各地广泛分布，栽培历史悠久，自张骞出使西域后传入中原，逐渐成为我国种植面积最大的人工牧草[7]。盐胁迫下，苜蓿种子的萌发和幼苗生长会受到抑制，且抑制程度随盐浓度的增大而加剧[8]。50～200 mmol·L-1NaCl胁迫就会显著降低紫花苜蓿的产量[9]。

蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)为豆科苜蓿属一年生植物。蒺藜苜蓿原产于地中海地区，在我国主要分布于安徽、江苏、四川等省[10]。因其具有基因组小、根瘤固氮、自花授粉、生长期短、遗传转化效率高以及对盐分的一定耐受性等特点，被认为是豆科植物以及耐盐性研究的模式植物[11]。

金花菜(Medicagopolymorpha)又名秧草，植株耐寒、抗病、抗逆性强，故在其全生育期内无须施肥和撒药，是名副其实的绿色无公害食品，也是长江中下游地区民众自古以来的日常时令蔬菜，在扬中地区有“救命草”的美誉，扬中地区大棚栽培的秧草加工成的可食用嫩芽干粉具有蛋白高、脂肪低、膳食纤维高的优点[12]。

工农业的迅速发展，不可避免地导致污染的加剧，进而使盐碱化土地的面积不断扩大[13]。对作物盐害及其耐盐机理的研究表明，化学调控手段是提高作物耐盐性的有效措施之一[14]。寻求一种高效、低成本的方式，来有目的地提高苜蓿抗盐性，对于比较不同苜蓿属植物之间抗盐机制的差异，进而筛选出耐盐的种质资源具有重要意义。

油菜素内酯(brassinolide, BR)是一种广泛存在于植物中的甾醇类新型植物激素，植物经其低浓度处理便能表现出明显的生理效应[15]。研究表明，BR在植物生长发育的各个阶段都起到调控作用，并能改善植物的生长代谢[16]。起初人们对油菜素内酯的认识仅仅停留在它能促进植物生长，随着研究的深入，人们逐渐认识到油菜素内酯在植物生长发育中起到的不可替代的作用并且开始尝试研究油菜素内酯对植物抗逆性的影响机制。

目前，研究如何利用外源油菜素内酯(epi-brassinolide, EBR)提高植物耐盐性的项目主要集中在番茄(Lycopersiconesculentum)，棉花(Gossypiumspp.)和水稻(Oryzasativa)这几种植物，而对苜蓿属植物的研究较少。研究方向主要聚焦于光合作用、渗透调节等领域，而对于NaCl胁迫下植物体内离子稳态的研究还相对较少。进一步加强在这一方面的研究，可以为阐明利用EBR提高植物抗盐性的生理机制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验选用3种苜蓿属植物：蒺藜苜蓿R108，紫花苜蓿WL525，金花菜。3种苜蓿属植物种子均来自扬州大学种质资源库，供试EBR购自源叶生物公司，使用前用98%的乙醇溶解后稀释到0.1 μmol·L-1，乙醇最终含量为0.1% (v/v)，用吐温-80作为展开剂，最终含量为0.1% (v/v)。试验在扬州大学草学光照培养室内进行，于2016年7月开始，至2016年9月结束。

1.2 苜蓿材料培养方法

用6%的NaClO溶液对3种苜蓿种子分别消毒5 min，将去离子水漂洗过3遍的种子均匀分布在铺有2层滤纸的培养皿上，并用去离子水使培养皿内部保持湿润，放入GZP-350(s)光照培养箱中在黑暗条件下发芽，温度控制在30 ℃。1 d后将长出小芽的种苗移入细沙中进行生根培养，3 d后，将苜蓿幼苗从细沙中取出，固定在孔可收缩的泡沫板中，1个小孔中种入同种苜蓿幼苗3株，1块泡沫板种3种不同苜蓿属植株，然后将种有幼苗的白色泡沫板转移到装有8 L Hoagland’s营养液的塑料盆(高13 cm、宽28 cm、长35 cm)中进行培养。为保证处理液浓度稳定，每7 d更换1次营养液。每天采用450 μmol·m-2·s-1的生物钠灯光照14 h(7:00-21:00)，光照/黑暗时的温度是30/25 ℃。为保证氧气供给，植物生长期间，用气泵向培养盆中通气。此外，为防止蓝藻滋生，对塑料盆进行遮光处理。

试验期间，分别配制营养液的浓缩母液备用，微量元素1000倍浓缩液，铁钠盐1000倍浓缩液，大量元素Ca2+、K+为400倍浓缩液，Mg2+、NH4+为1000倍浓缩液。

1.3 盐胁迫处理及EBR处理

实验设4个处理：CK(完全营养液)、0.1 μmol·L-1EBR、150 mmol·L-1NaCl、0.1 μmol·L-1EBR+150 mmol·L-1NaCl，每个处理4个重复。苜蓿植株在完全营养液中培养30 d后，对其开始进行盐胁迫处理20 d，为使其逐步适应盐胁迫环境，分为3个梯度：50，100，150 mmol·L-1分3 d提高至150 mmol·L-1。采用叶片喷施的方法，将0.1 μmol·L-1EBR溶液均匀地喷施在叶片正反面，喷到有液滴为止。

1.4 干重及钾、钙、钠、镁的测定方法

处理结束后，将每个处理的植株，分成根、茎、叶三部分。分离后的根、茎、叶分别编号放入信封内，先在105 ℃烘箱内杀青30 min，再调到65 ℃持续烘干48 h后称量测定干物质重量，并求其平均值。将根、茎、叶的组织样品用微型粉碎仪粉碎，之后称取0.1 g放入坩埚中，先在电炉上灼烧至无烟，再放入马弗炉中550 ℃下灰化3 h，灰化后的灰分加入2～3滴浓硝酸溶解，过滤(除去不溶于硝酸的杂质)后用去离子水定容到25 mL，取2 mL溶液定容至10 mL，装入10 mL离心管中，用等离子发射光谱仪(ICP,PE3300DV, Perkin Elmer, Germany)测定Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量。

1.5 离子运输比和运输选择性比率计算

运输比(transport ratio,TR)是表示所有离子(包括阳离子、阴离子)的运输倍数，反映的是分布梯度，直接以阴、阳离子浓度计算得到，计算公式为[17]：

TR (X)=a器官(X)/b器官(X)

式中：a、b代表根、茎、叶;X代表Na+、K+、Ca2+、Mg2+的含量。

运输选择性比率(transport selectivity ratio,TS)是表示阳离子间在运输方面的协同或拮抗关系，是以离子间的浓度比值进行计算而得到，计算公式为[18]：

TS(Y, Na+)=a器官(Y/Na+)/b器官(Y/Na+)

式中：a、b代表根、茎、叶;Y代表K+、Ca2+、Mg2+的含量; TS(Y, Na+)越大，说明a器官从b器官中选择性运输Y离子的能力越强。

1.6 数据分析方法

采用SPSS 18.0软件分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中Na+含量的影响

由图1可知，NaCl处理使苜蓿属3种植物根、茎和叶中的Na+含量显著升高(P<0.05)。NaCl处理下蒺藜苜蓿、紫花苜蓿和金花菜根中的Na+含量分别为CK的17.26、10.29和12.70倍；茎的Na+含量分别为CK的31.21、6.79和21.85倍；叶的Na+含量分别为CK的37.59、12.08和46.38倍。NaCl胁迫下，蒺藜苜蓿根、茎、叶中Na+含量的升高幅度是苜蓿属3种植物中最大的，蒺藜苜蓿茎和叶中的Na+含量显著高于紫花苜蓿和金花菜(P<0.05)。在苜蓿属3种植物中，紫花苜蓿根、茎、叶中的Na+含量表现最低，其次为金花菜，表明蒺藜苜蓿受盐胁迫的影响最大，紫花苜蓿受盐胁迫的影响最小。NaCl胁迫时，紫花苜蓿根中Na+含量高于茎和叶；蒺藜苜蓿茎和叶中Na+含量高于根；金花菜体内Na+分布与蒺藜苜蓿相同。

NaCl胁迫下喷施EBR后，苜蓿属3种植物根、茎、叶中的Na+含量降低。与NaCl处理相比，金花菜的茎和叶中的Na+含量显著降低了16.09%和18.41%(P<0.05)。NaCl胁迫下喷施EBR后，紫花苜蓿茎和叶中的Na+含量显著低于蒺藜苜蓿(P<0.05)，蒺藜苜蓿根、茎、叶中Na+含量在苜蓿属3种植物中表现最高。

2.2 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中K+含量的影响

由图2可知，NaCl处理后，蒺藜苜蓿和紫花苜蓿根、茎、叶中的K+含量显著降低(P<0.05)，金花菜根、茎、叶中的K+含量均降低，其中茎、叶中的K+含量显著降低(P<0.05)。与CK相比较，NaCl处理下蒺藜苜蓿、紫花苜蓿和金花菜根中K+含量分别降低了64.49%、37.92%和43.80%；茎中K+含量分别降低了62.68%、54.86%和67.04%；叶中K+含量分别降低了29.31%、20.91%和28.19%。在苜蓿属3种植物根、茎、叶中K+含量的降幅中，蒺藜苜蓿降幅最大，紫花苜蓿降幅最小。NaCl胁迫下，紫花苜蓿根中K+含量显著高于蒺藜苜蓿和金花菜(P<0.05)。

NaCl胁迫下喷施EBR后，苜蓿根、茎、叶中的K+含量升高。与NaCl处理相比，蒺藜苜蓿和金花菜茎中的K+含量显著升高了62.17%和79.10%(P<0.05)。喷施EBR后，金花菜茎中的K+含量显著高于紫花苜蓿(P<0.05)。

图1 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、 叶中Na+含量的影响Fig.1 Effects of EBR on Na+ content in roots, stems and leaves of Medicago species under NaCl stress

图2 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、 叶中K+含量的影响Fig.2 Effects of EBR on K+ content in roots, stems and leaves of Medicago species under NaCl stress

不同小写字母表示同一草种不同处理差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示同一处理不同草种差异显著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters indicate the significant differences among the different treatment of the same grass (P<0.05). Different capital letters indicated the significant differences among the same treatment of the different grass (P<0.05).The same below.

2.3 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中Ca2+含量的影响

由图3可知，NaCl处理使苜蓿属3种植物根、茎、叶中的Ca2+含量降低。与CK相比较，NaCl处理下金花菜茎中Ca2+含量显著降低了44.50%(P<0.05)，蒺藜苜蓿和紫花苜蓿叶中Ca2+含量显著降低了37.69%和23.10%(P<0.05)。NaCl胁迫下喷施EBR后，苜蓿属3种植物根、茎、叶中的Ca2+含量升高。与NaCl处理相比，蒺藜苜蓿根中的Ca2+含量显著升高了38.36%(P<0.05)。喷施EBR后，蒺藜苜蓿根中的Ca2+含量显著高于紫花苜蓿和金花菜(P<0.05)。

2.4 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中Mg2+含量的影响

由图4可知，NaCl处理后，蒺藜苜蓿和金花菜根、茎、叶中的Mg2+含量降低，紫花苜蓿除根中Mg2+含量无明显变化外，茎、叶中的Mg2+含量也有所降低。与CK相比较，NaCl处理下金花菜根中的Mg2+含量显著降低了16.55%(P<0.05)，3种苜蓿茎中的Mg2+含量分别显著降低了40.94%、30.80%和38.85%(P<0.05)，3种苜蓿叶片中Mg2+含量分别显著降低了31.74%、33.94%和31.06%(P<0.05)。NaCl胁迫下，金花菜茎中的Mg2+含量显著高于蒺藜苜蓿(P<0.05)，紫花苜蓿叶中的Mg2+含量显著低于蒺藜苜蓿和金花菜(P<0.05)。

NaCl胁迫下喷施EBR后，苜蓿根、茎、叶中的Mg2+含量均升高，但未达显著水平(P>0.05)。

图3 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、 叶中Ca2+含量的影响Fig.3 Effects of EBR on Ca2+ content in roots, stems and leaves of Medicago species under NaCl stress

图4 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、 叶中Mg2+含量的影响Fig.4 Effects of EBR on Mg2+ content in roots, stems and leaves of Medicago species under NaCl stress

2.5 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的影响

由表1可知，NaCl处理使苜蓿属3种植物根、茎、叶中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+显著降低(P<0.05)。与CK相比较，NaCl处理下蒺藜苜蓿根中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+分别降低了97.94%、93.01%和94.86%；茎中分别降低了98.72%、97.65%和98.00%；叶中分别降低了98.20%、98.39%和98.23%。紫花苜蓿根中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+分别降低了94.43%、92.70%和90.40%；茎中分别降低了94.94%、89.08%和92.99%；叶中分别降低了93.95%、94.27%和95.01%。金花菜根中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+分别降低了96.85%、96.46%和94.85%；茎中分别降低了98.86%、98.05%和97.89%；叶中分别降低了98.58%、98.52%和98.64%。在苜蓿属3种植物中，紫花苜蓿根、茎、叶K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的降幅最小，蒺藜苜蓿降幅最大。NaCl胁迫下，紫花苜蓿根中的K+/Na+显著高于蒺藜苜蓿和金花菜(P<0.05)，其茎和叶中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+也都显著高于其他两种苜蓿(P<0.05)。

表1 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物根、茎、叶中K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的影响Table 1 Effects of EBR on K+/Na+, Ca2+/Na+, Mg2+/Na+ in roots, stems and leaves of Medicago species under NaCl stress

注：不同小写字母表示同一草种不同处理差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示同一处理不同草种差异显著(P<0.05)，下同。

Note：Different lowercase letters indicate the significant differences among the different treatment of the same grass (P<0.05). Different capital letters indicated the significant differences among the same treatment of the different grass (P<0.05). The same below.

NaCl胁迫下喷施EBR后，除蒺藜苜蓿叶中和金花菜茎中的Mg2+/Na+没有显著变化外，苜蓿属3种植物根、茎、叶中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+均有所升高。喷施EBR后，紫花苜蓿茎和叶中的K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+都显著高于其他两种苜蓿属植物(P<0.05)。

2.6 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物体内无机离子运输比的影响

由表2可知，NaCl处理使蒺藜苜蓿中K+、Ca2+、Mg2+由根向茎的运输比降低，K+由茎向叶的运输比升高显著(P<0.05)，升高了105.54%；紫花苜蓿中K+、Mg2+由根向茎的运输比显著降低(P<0.05)，分别降低了27.27%和33.76%，K+由茎向叶的运输比升高显著(P<0.05)，升高了74.85%，而Ca2+由茎向叶的运输比显著下降(P<0.05)，下降了20.64%；金花菜中K+、Ca2+、Mg2+由根向茎的运输比降低，由茎向叶的运输比升高。NaCl胁迫下，蒺藜苜蓿中Na+从根到茎及从茎到叶的运输比升高，而紫花苜蓿中Na+从根到茎的运输比下降。NaCl胁迫下，苜蓿属3种植物K+从根到茎的运输比下降，而从茎到叶的运输比上升。

NaCl胁迫下喷施EBR后，与NaCl处理相比较，金花菜中K+由茎向叶的运输比显著降低了44.64%(P<0.05)。喷施EBR后，蒺藜苜蓿中Mg2+由根向茎的运输比显著低于紫花苜蓿和金花菜(P<0.05)，而由茎向叶的运输比显著高于其他2种苜蓿属植物(P<0.05)。

表2 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物体内无机离子运输比的影响Table 2 Effects of EBR on transportation ratio of inorganic ions in Medicago species under NaCl stress

2.7 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物体内阳离子运输选择性比率的影响

由表3可知，NaCl处理使蒺藜苜蓿中K+、Ca2+、Mg2+由根向茎的运输选择性比率降低，金花菜中K+、Ca2+、Mg2+由根向茎的运输选择性比率降低，其中K+运输选择性比率与CK相比达显著水平(P<0.05)。金花菜中K+由茎向叶的运输选择性比率显著升高了19.82%(P<0.05)，Mg2+由茎向叶的运输选择性比率显著降低了38.30%(P<0.05)。NaCl胁迫下，紫花苜蓿中K+、Ca2+、Mg2+从根向茎的运输选择性比率显著高于其他两种苜蓿(P<0.05)。

表3 EBR对NaCl胁迫下苜蓿属植物体内阳离子运输选择性比率的影响Table 3 Effects of EBR on cation transport selectivity ratio in Medicago species under NaCl stress

NaCl胁迫下喷施EBR后，蒺藜苜蓿中K+、Ca2+、Mg2+由根向茎的运输选择性比率升高，而由茎向叶的运输选择性比率降低，其中K+运输选择性比率与NaCl处理相比达显著水平(P<0.05)。金花菜中K+由茎向叶的运输选择性比率显著降低了42.34%(P<0.05)。喷施EBR后，紫花苜蓿中Ca2+从根向茎的运输选择性比率显著高于蒺藜苜蓿和金花菜(P<0.05)。

3 讨论

NaCl胁迫下，植物在吸收矿质元素的过程中，盐离子影响了植物对养分离子的吸收，造成养分胁迫。本研究中，NaCl处理使得部分苜蓿属植物的Na+含量显著升高，K+、Ca2+、Mg2+含量及K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+显著降低。表明高浓度的Na+在与K+、Ca2+、Mg2+竞争的过程中，对三者的吸收产生了抑制作用，打破了植物体内的离子平衡。NaCl胁迫下，Na+进入植物体内，以提高其渗透势，增强植株的吸水能力，避免生理干旱的产生。但过高浓度的Na+也会造成毒害，破坏植物体内的离子平衡。渗透调节是植物应对盐胁迫的主要措施之一，K+、Ca2+、Mg2+在渗透调节过程中至关重要[19]。K+是构成细胞渗透势的主要离子，其浓度高低对气孔的开闭有调节作用。Ca2+在植物的信号传导过程中充当第二信使，能够提高植物对逆境的适应性。Mg2+是叶绿素分子的组成元素之一，维持质子跨膜运输浓度梯度，确保光合磷酸化的正常进行[20]。EBR降低了苜蓿属植物体内Na+含量，提高了K+、Ca2+、Mg2+含量及K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+，表明EBR对盐胁迫下植物体内的营养元素有一定的调节作用，能够缓解盐胁迫造成的离子失衡，维持植物体内的正常代谢水平，提高苜蓿属植物的耐盐性。

本研究中，苜蓿属3种植物在NaCl胁迫下体内的无机离子运输比和阳离子运输选择性比率发生紊乱，K+、Ca2+、Mg2+从根向茎的运输选择性比率都有所降低，表明NaCl胁迫下苜蓿属三种植物根中K、Ca、Mg 3种元素向茎中转运的选择性降低，根中截留Na+的能力减弱；而K+、Ca2+从茎向叶的运输选择性比率都有所上升，这表明苜蓿属3种植物茎中K+、Ca2+向叶片的运输选择性较高，茎中截留Na+的能力较强，这是由于叶片是植物进行光合作用的主要器官，需要大量养分离子以保证其正常运转，故K+、Ca2+向叶片中大量转运，K+、Ca2+从茎向叶的运输比也大幅提升。

EBR能够提高盐胁迫下植物的根系活力[20]，从而增加对K+、Ca2+、Mg2+的吸收，减少对Na+的吸收，维持植物体内的离子平衡，缓解因盐胁迫造成的离子毒害现象。这可能是由于EBR对于植物的光合能力有一定的提高，以此来促进体内离子的分配与运输。

紫花苜蓿在盐胁迫下，其体内的Na+含量及K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+明显高于蒺藜苜蓿和金花菜，在苜蓿属3种植物中，紫花苜蓿根、茎、叶中K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的降幅最小，蒺藜苜蓿降幅最大，表明紫花苜蓿耐盐性较强，蒺藜苜蓿耐盐性较弱。此外，紫花苜蓿在盐胁迫下根中Na+含量高于茎和叶；而蒺藜苜蓿处于NaCl胁迫时，茎和叶中Na+含量高于根，由此推测紫花苜蓿和蒺藜苜蓿体内存在不同的运输机制。紫花苜蓿在遭受盐胁迫时，根系抑制对Na+的吸收，减少Na+从根向茎和叶的运输，减少植株体内的Na+含量，从而达到拒盐的效果；而蒺藜苜蓿将根中的Na+向茎和叶中运输，叶受到较重的Na+毒害后脱落，从而维持了顶端生长点的正常生长。

4 结论

1)NaCl胁迫会抑制苜蓿属植物的生长，影响植物体内K+、Ca2+、Mg2+离子的分配和运输。

2)EBR能有效缓解NaCl胁迫对苜蓿属植物生长的抑制作用，调控苜蓿属植物体内的无机离子运输比和阳离子运输选择性比率，维持植物体内的离子平衡，从而提高苜蓿属植物的耐盐性。

3)在同等盐胁迫下，紫花苜蓿生长较好，耐盐性较强，蒺藜苜蓿耐盐性较弱。

4)在盐胁迫下，EBR抑制紫花苜蓿根部对Na+的吸收，减少其离子毒害作用；EBR促进蒺藜苜蓿将根中的Na+向茎和叶中运输，通过叶片的脱落，维持生长点的正常生长。