植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法

刘悦

摘 要 褐变是植物组织培养中的普遍存在的现象，已经成为影响组织培养成功的重要因素，并且已成为组织培养中的一大难题。本文揭示了褐变的发生机制及控制机理、影响褐变的因素，并于此提出了防治褐变的措施，以期为解决褐变问题提供理论依据。

关键词 植物组织 褐变 机制 防治

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A

褐变在植物组织培养过程中普遍存在，国内学者普遍认为褐变能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在，并且证明了褐变度与总酚含量以及PPO活性之间的关系因品种而异。而国外学者Mayer和Harel则注意到正常果实组织中虽然存在有酚类物质和PPO，却并不发生褐变，指出果实中酚类物质和PPO在细胞中可能是区域化状态分布。

1褐变的发生机制

关于褐变的发生机制，目前认为褐变分为两种：即酶促褐变和非酶促褐变。但诸多研究认为引起褐变发生的主要是酶促褐变。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为底物创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，再进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而才引起褐变。

2影响褐变的因素

不同的材料、环境条件、因素或操作手段都会严重影响褐变发生的程度，不同的褐变程度也跟实验结果、研究目的息息相关。在外植物体材料的基因型与生理状态确定的情况下，外植物体的种类和大小、培养条件是影响褐变的主要因素。

2.1外植体的种类和大小

一般认为，木本植物比草本植物的外植体在培养中更易发生褐变。外植体小的材料，因为切口所占比例较大而较易发生褐变。切口越大，酚类被氧化的面积就越大，褐变现象越严重。

2.2培养条件

培养室的温度控制在15℃～20℃，可有效地防止褐变的发生。高温一方面不利于伤口的愈合，另一方面会增强多酚氧化酶的生物活性，从而加速氧化过程，使植物材料的褐变更为严重。其次，光照强度也能影响褐变的发生及褐化程度。在黑暗条件下外植体褐变严重，在光照条件下外植体褐变发生晚、程度轻，光照强度增加外植体褐变严重。

3防治褐变的方法

3.1选择适宜的外植体和培养条件

取材时，需要注意除时间以及采光等外，还应注意外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。同时，适当改变培养基的状态、硬度、pH值、缩短转接周期等方法也可减轻褐变的毒害。在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大。褐变率低。在水稻体细胞培养中，pH值为4.5～5.0时MS培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5 ～ 6.0时愈伤组织严重褐变。在外植体接种后1-2 d即转移至新鲜培养基中或同一培养基的不同部位，可以防止酚类物质在伤口周围积累过多，连续转移几次即可防止褐变。

3.2使用抗褐变剂和吸附剂

在组培时，在培养基中加入抗氧化剂、增效剂或使用抗氧化剂和增效剂对材料预处理，可抑制外植体的酶促褐变。在植物组培中用于抑制褐化常用的抗氧化剂有：抗坏血酸（Vitamin C）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）。此外还有柠檬酸、L-半胱氨酸（L-Cys）、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇等。VC和柠檬酸主要在早期起作用，随培养时间的延长作用逐渐消退，亚硫酸钠在中后期作用较好，但对植物具有一定毒害作用，不宜单独添加。抗氧化剂对外植体的培养会起到一定的副作用，培养基添加浓度不宜过高，一般在200mg/L以下，且多用于初期培养而不宜长期培养，还原性抗氧化剂在使用时应注意保持其还原性，一般最好过滤除菌使用，不要与培养基一起高温灭菌。

综上所述，褐变发生的机理在于醌类化合物与蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，进而导致植物生长缓慢，甚至死亡。而外植体材料基因型与其外在形态，和材料、环境、操作等诸多因素影响其褐变的发生。因此，择适宜的外植体和培养条件，或者使用抗褐变剂和吸附剂，可以遏制褐变的发生。如今，组培技术已大量应用于花卉生产、农作物栽培以及特种经济植物的幼苗、脱毒苗，使作物种植逐步走向集中控制化、规模化、自动化。但在试验和生产过程中也经常会出现外植体褐变、污染和玻璃化现象这三大难。因而，如何防治褐变的产生和加强外植体褐变方面的研究显得尤重要。

参考文献

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