高瑞灏 王有森 刘德美
[摘要] 目的 了解嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株在三氯生诱导下耐药性和外排泵SmeDEF表达的变化。 方法 选取2017年3~6月潍坊市人民医院细菌室培养的嗜麦芽窄食单胞菌分离株10株,比较三氯生诱导前后嗜麦芽窄食单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。监测三氯生诱导前后菌株外排泵smeD基因RT-PCR扩增后的表达水平。 结果 对抗生素敏感的10株菌泵抑制呈阳性或者阴性表现。其中6株菌经三氯生诱导后对左氧氟沙星的MIC值比诱导前高3~5个稀释度,加用泵抑制CCCP后,6株诱导后的菌株MIC值均有所降低。泵抑制剂阳性菌株抗生素过夜组和对数生长期添加组均明显高于无抗生素组的smeD的表达。 结论 嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株在三氯生诱导下对部分抗生素的耐药性有所提高,这与外排泵SmeDEF的表达有关。
[关键词] 三氯生;嗜麦芽窄食单胞菌;抗生素耐药性;外排泵;诱导
[中图分类号] R378 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2018)08(b)-0113-04
[Abstract] Objective To investigate the changes of Antibiotic resistance of Stenotrophomonas maltophilia and the expression of efflux pump SmeDEF in the induction of Triclosan. Methods From March to June in 2017, 10 strains of Stenotrophomonas maltophilia isolated from bacterial lab cultured in Weifang People′s Hospital were selected. The MIC of Stenotrophomonas maltophilia before and after the induction of Triclosan was compared and the repression level of the mRNA of efflux pump smeD was monitored by RT-PCR. Results The inhibition of 10 strains of bacteria pump sensitive to antibiotics was positive or negative. The levofloxacin MIC of 6 strains was 3-5 dilution higher than that before induction, and the MIC of 6 strains was reduced when the efflux pump inhibitor CCCP was used. The repression level of smeD of both pump inhibitor positive strains antibiotic overnight group and logarithmic growth addition group was significantly higher the no antibiotic group. Conclusion The resistance to antibiotics of Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates induced by triclosan has increased, which is related to the expression of efflux pump SmeDEF.
[Key words] Tricolsan; Stenotrophomonas maltophilia; Antibiotic resistance; Efflux pump; Induction
三氯生,化学名称:2,4,4′-三氯-2′-羟基二苯基醚,一种非离子性的氯化苯酸化合物,广泛应用于牙膏、香皂、家庭清洁用品、表面清洁剂以及添加在不同材料中(无菌建筑中应用的纺织物和混凝土)[1-5]。三氯生是广泛应用的杀菌剂中的一种,在较低浓度下三氯生就可通过损害细胞膜杀死微生物,表现出抑菌性[6]。三氯生具有广谱抗菌性,但对革兰阴性菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性低。杀菌剂用来防止微生物的定植在物体表面,但同时也可对周围环境中细菌的繁殖产生意料之外的影响[7-9]。嗜麦芽窄食单胞菌是广泛分布于环境中的一種专性需氧的非发酵革兰阴性杆菌,适于生存在潮湿的条件下,如:水、植物的根部、土壤。嗜麦芽窄食单胞菌为条件致病菌,可以定植于医用器材的表面,如:血液透析装置、呼吸机管道、导尿管、中心静脉置管等。随着抗生素的广泛使用以及介入治疗的开展,嗜麦芽窄食单胞菌感染越来越普遍,成为越来越重要的医院内感染病原体。嗜麦芽窄食单胞菌具有多种天然耐药机制,其中多重耐药(MDR)外排泵机制为最主要的一种,介导对多种抗生素的耐药,并且外排泵的表达受抗生素的诱导。不同的实验研究显示三氯生的耐药性也与MDR外排泵的表达有关[10-13]。
1 材料与方法
1.1 材料试剂与仪器
菌株来源:嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株,数量10株,来自潍坊市人民医院细菌室,分离自痰液、尿液。铜绿假单胞菌ATCC27853作药敏试验质控菌。
药品与试剂:左氧氟沙星购自潍坊市人民医院;三氯生、泵抑制剂CCCP,美国SIGMA公司生产。LB肉汤培养基、MH琼脂,上海生工公司产品。UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒,上海生工公司。
仪器:RT-PCR系统,Marker(DL-2000),上海生工公司。
1.2 方法[14]
1.2.1 MIC值检测 取MH琼脂平皿上过夜生长的单菌落,接种于LB肉汤培养基中,稀释,加入含有LB肉汤和左氧氟沙星的试管中,读取MIC,采用肉汤稀释法检测左氧氟沙星的MIC值。
1.2.2 三氯生诱导外排泵后左氧氟沙星MIC值检测 三氯生诱导外排泵后左氧氟沙星的MIC值同上法。取于LB肉汤中过夜增殖的菌液100 μL,倾倒于含有64 μg/mL三氯生的MH琼脂平皿上,35℃过夜孵育,挑取菌落接种于LB肉汤培养基中,读取MIC。
1.2.3 检测诱导前后smeD的表达 选取泵抑制剂阳性的菌株进行以下3组实验:第1组在LB肉汤中,35℃孵育;第2组LB肉汤中加入64 μg/mL三氯生后35℃孵育;第3组在对数生长期时向菌液中加入同样浓度的三氯生继续培养1 h,35℃孵育;3组均培养20 h。提取细菌总RNA,定量后取兩个稀释度(0.5、0.05 μg/μL)的RNA溶液进行RT-PCR,扩增smeD基因5′端的395 bp片段。
反应上游:D1 5′-CATGTTGCTGAGCCGAATCC-3′;反应下游:D2 5′-CAAGAGCCTTTCCGTCAT-3′。
2 结果
2.1 实验菌株的耐药特性
所选嗜麦芽临床分离株经纸片法检测耐药表型和一般特性均对左旋氧氟沙星、米诺环素、复方新诺明敏感。
2.2 左氧氟沙星诱导前后MIC值
4株对左氧氟沙星的MIC值比诱导前的MIC值高1~2个稀释度,其余6株对左氧氟沙星的MIC值比诱导前高3~5个稀释度。加用泵抑制剂CCCP后,MIC变化明显的6株嗜麦芽窄食单胞菌对左氧氟沙星的MIC值均有所降低,其余4 株无明显变化。见表1。
2.3 三氯生诱导前后smeD的RT-PCR结果
泵抑制剂阳性菌株在低浓度三氯生诱导后,smeD的mRNA水平增高,在两个RNA浓度下均见抗生素添加组比对照组的RT-PCR条带亮度高。作为内参的bala2 mRNA水平诱导前后无明显变化。泵抑制剂阳性菌株smeD的RT-PCR琼脂糖电泳结果见图1,泵抑制剂阳性菌株bala2的RT-PCR电泳结果见图2。
3 讨论
日趋广泛应用的杀菌剂可能造成抗生素的耐药性,将严重影响感染性疾病治愈的成功率。虽然目前没有确切的证据证明在自然环境中,杀菌剂可以选择耐抗生素的突变菌株,但是体外实验显示细菌种群可以暴露于某种杀菌剂中,例如三氯生。大多数研究已经对耐药性的分子基础有所探究[15]。
染色体编码MDR外排泵的表达受特殊转录调节子严密控制,多为阻遏子。在实验室正常生长条件下,MDR外排泵表达水平很低。然而,外排泵的表达可以被绑定在阻遏子上的效应器启动,并抑制阻遏子和操纵子的绑定[16]。虽然大部分关于细菌外排泵的研究都关注在对细菌耐药性影响的方面,但是抗生素并不是外排泵表达天然的诱导因素[17]。虽然外排泵可以外排多种底物,但是只有很少一部分配体可以作为效应器触发编码外排泵的操纵子的转录。
此次研究目的主要是探求消毒剂三氯生能否激活MDR外排泵的表达。SmeDEF属于耐药结节化细胞分化家族,并有三种蛋白构成:内膜蛋白,转运蛋白SmeE;外膜蛋白SmeF;以及膜融合蛋白SmeD。嗜麦芽窄食单胞菌是条件致病菌,表现出对多种抗生素低敏感性[18],并与高死亡率的各种感染有关[19]。嗜麦芽窄食单胞菌感染包括菌血症、心内膜炎、肿瘤患者感染、支气管感染等[20-21]。这种病原体基因组潜藏大量抗生素耐药性决定簇[22],包括:抗生素钝化酶、qnr决定簇、多种MDR外排泵(如:SmeABC、SmeDEF、SmeJKL、SmeYZ,其中SmeDEF是嗜麦芽窄食单胞菌耐药性中最重要的MDR外排泵)。SmeDEF的表达受SmeT的调控,SmeT是转录抑制因子,其编码基因位于smeDEF基因片段互补链的上游[23-24]。SmeT属于转录抑制因子TetR家族。这个家族成员在有关二聚作用和效应器绑定有关的氨基末端和羧基端基因序列表现出特征性的螺旋-转角-螺旋DNA-绑定基序[25]。SmeT结构分析显示它与TetR转录抑制因子家族中的TetR、QacR、TtgR结构相似度高[26],与CprB[27]、EthR[28]、CmeR[29]、AcrR[30]、ActR[31]、IcaR[32]结构相似度低。然而,不同于其他转录抑制因子,SmeT末端延长,可能调节其与DNA、特性以及效应器绑定口袋的大小的相互作用。当效应器绑定口袋未与效应器绑定时,它是TetR家族成员中最小的。SmeT绑定在smeDEF启动子序列中的一个28 bp长的假回文结构上。SmeT与操纵序列的绑定,同时抑制smeDEF和smeT的转录,通过在空间上阻碍RNA聚合酶和DNA的结合来实现。过度表达smeDEF发生在三氯生或抗生素诱导的突变株中,SmeT表现出阻碍抑制因子与操纵子结合。
因为染色体编码的MDR外排泵的表达受局部阻抑蛋白的降调节[33],并且它们的表达可以被特殊的效应器触发,所以目前研究探索作为MDR外排泵SmeDEF作用底物的三氯生可能诱导这种抗生素耐药性决定因素的表达,因此表现出不易察觉的诱导抗生素耐药性的表型[34]。体外实验数据与体内三氯生诱导smeDEF表达相关联,提示三氯生是很好的MDR外排泵smeDEF表达的诱导剂,smeDEF表达的增加可以缩小MIC值。研究结果显示暴露于三氯生中的嗜麦芽窄食单胞菌可以出现过度表达SmeDEF的突变菌株,所以三氯生可以诱导抗生素耐药表型。
体外实验数据与体内试剂作用情况具有一定的差异,有两个假说可以解释这个差异。第一,体内和体外出现和增殖耐药细菌种群的概率不同。第二,耐多药的突变菌株在环境中的增殖能力可能被削弱。在这种情况下,即使这些突变株被选择出来,它们也可能被不耐抗生素的耐三氯生的菌株取代。在体外研究中,在将来推测有机体耐药能力方面有很大用处。目前已完成的关于抗生素耐药性和应用家庭清洁剂相关性的研究很少[35]。然而,在家中和临床设施上使用不必要的三氯生和其他杀菌剂仍存在让人像担忧的问题。更多的研究要求了解三氯生选择的抗生素耐药突变菌株在自然环境中的行为,以便推测将来三氯生和抗生素耐药性相关性的发展趋势。
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(收稿日期:2018-05-11 本文編辑:李岳泽)