特应性皮炎患者皮肤马拉色菌菌量及其与病情严重程度相关性研究

吴红梅 陆茂 欧美 罗媛元

[摘要] 目的 检测特应性皮炎（AD）患者皮肤马拉色菌菌量，探讨其与病情严重程度的相关性。 方法 选取成都医学院第一附属医院2017年4～9月就诊的轻中重度AD患者各20例，采集其面部、上肢皮损区和非皮损区以及20例健康对照者相应区域的皮肤鳞屑标本，采用真菌荧光染色法在高倍镜下记录马拉色菌的密度，并分析马拉色菌密度与病情严重程度的相关性。 结果 轻中重度AD患者面部皮损区、非皮损区马拉色菌密度均明显高于上肢皮损区、非皮损区（P < 0.05），轻中重度AD患者各部位马拉色菌密度均明显高于健康对照者相应区域（P < 0.05），AD患者各部位马拉色菌密度与病情严重程度均无相关性（P > 0.05）。 结论 AD患者皮肤马拉色菌菌量与部位有关，与病情严重程度无关。

[关键词] 特应性皮炎；马拉色菌；荧光染色法；病情严重程度

[中图分类号] R758 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（b）-0096-04

[Abstract] Objective To detect the amount of Malassezia in the skin of patients with atopic dermatitis （AD）， and explore its correlation with the disease severity. Methods 20 mild， 20 moderate and 20 severe AD patients were selected from the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College from April to September 2017. Skin scales were collected as samples from the lesion and non lesion areas on the face and upper limb of AD patients as well as the corresponding areas of 20 healthy control subjects. The density of Malassezia was recorded at high magnification by fluorescent staining method. Then the correlation between the density of Malassezia and the disease severity was analyzed. Results The density of Malassezia in the lesion and non lesion areas on the face of the mild， moderate and severe AD patients was significantly higher than those of the upper limbs （P < 0.05）. The density of Malassezia in each skin area of mild， moderate and severe AD patients was significantly higher than that of healthy control subjects （P < 0.05）. The density of Malassezia in each skin area of AD patients was not correlated with the disease severity （P > 0.05）. Conclusion The amount of Malassezia in the skin of AD patients is related to the site， but not to the disease severity.

[Key words] Atopic dermatitis； Malassezia； Fluorescent staining method； Disease severity

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种临床常见的复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病，其病因和发病机制尚不清楚，可能是遗传因素、免疫因素、有缺陷的皮肤屏障功能、环境因素、感染因素等共同作用的结果。与感染因素有关的微生物主要有金黄色葡萄球菌，其次是真菌（包括马拉色菌及念珠菌等）[1-2]。目前国外有关马拉色菌在AD患者皮肤定植情况的报道较多，但检测结果差异较大，可能与种族、地区及检测方法有关[3-4]，而国内相关研究报道很少。本研究采用真菌荧光染色法检测AD患者面部、上肢皮损区和非皮损区马拉色菌菌量，并分析其与病情严重程度的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取成都医学院第一附属医院（以下简称“我院”）2017年4～9月就诊的轻中重度AD患者各20例，病情严重程度采用湿疹面积及严重度指数评分法：<7分为轻度，7～21分为中度，>21分为重度[5]。其中轻度AD，男12例，女8例；平均年龄（4.56±3.93）岁；平均病程（15.69±8.56）个月。中度AD，男11例，女9例；平均年龄（5.34±4.28）岁；平均病程（19.14±10.02）个月。重度AD，男9例，女11例，平均年龄（7.27±4.45）岁；平均病程（20.69±12.14）个月。20名健康对照者来自我院工作人员子女，男8例，女12例，平均年龄（6.43±4.79）岁。各组研究对象性别、年龄、病程等比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合AD诊断标准[6]；②面部、上肢均有皮损区和非皮损区；③检测前2周每周洗浴3～5次；④能配合检测者。排除标准：①2周内使用抗真菌药物和糖皮质激素史；②采样前24 h内在采样部位使用任何药物或医用护肤品；③采样前24 h内进行洗浴；④伴有其他皮肤病；⑤伴有恶性肿瘤或其他严重疾患。

1.3 检测方法

用市售透明胶带（宽1 cm）采集AD患者面部、上肢皮损区和非皮损区以及健康对照者相应区域的皮肤鳞屑，所有检测对象均以相同力度将胶带与皮肤紧密粘贴，每个区域重复粘贴3次，每次5 s。然后将胶带均匀贴附在滴有真菌荧光染色液（南京汉瑞生物科技有限公司）的载玻片上，在BX51TF型荧光显微镜（日本奥林巴斯有限公司）下观察马拉色菌并记数。参考Conti等[7]的标准并进行改良，读取孢子密集区，取5个高倍镜视野的菌量，取平均数：①≤5个，为-；②>5～15个，为+；③>15～30个，为++；④>30个，为+++。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，两组单向有序分类资料比较采用秩和检验，多组单向有序分类资料比较采用Ridit分析，双向有序分类变量间相关性分析采用Spearman秩相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD患者、健康对照者各部位马拉色菌密度比较

AD患者、健康对照者各部位马拉色菌密度比较结果显示：①AD患者面部皮损区、非皮损区和健康对照者面部马拉色菌密度均明显高于上肢皮损区，差异有统计学意义（P < 0.05）；②AD患者各部位马拉色菌密度均明显高于健康对照者相应区域，差异有统计学意义（P < 0.05）；③AD患者同一部位皮损区与非皮损区比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

按病情严重程度分类分析，结果显示：①AD患者面部皮损区、非皮损区马拉色菌密度均明显高于上肢皮损区、非皮损区，差异有统计学意义（P < 0.05）；②轻、中、重度AD患者与健康对照者同一部位比较，马拉色菌密度差异均有统计学意义（P < 0.05），其中AD患者各部位马拉色菌密度均明显高于健康对照者相应区域，差异有统计学意义（P < 0.05），轻、中、重度AD患者同一部位比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；③AD患者同一部位皮损区与非皮损区比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 AD患者各部位马拉色菌密度与病情严重程度相关性分析

AD患者各部位马拉色菌密度与病情严重程度均无相关性（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

马拉色菌是正常人皮肤的常驻菌群，其与AD发病的关系尚不清楚。基于分离培养的形态学和生理生化学马拉色菌鉴定方法由于存在培养环节对检测的影响，并不能真实反映马拉色菌在皮肤原位的定植情况。本研究在取材时采用胶带直接粘贴表皮，未改变标本中真菌在皮肤表面的位置和数量，因此可以直观检测AD患者皮肤原位的马拉色菌菌量。马拉色菌在AD患者和正常人群皮肤上主要以孢子形態存在，且载量较少，临床上常用乳酸酚棉蓝、派克墨水等染色法对其进行检测[8-10]。近年来，真菌荧光染色法逐渐应用于马拉色菌镜检，它通过特殊的荧光素与真菌细胞壁的几丁质发生特异性结合，在荧光显微镜下可见真菌清晰的轮廓，便于寻找和识别，同时荧光染料亲和力高，能使少量真菌着色，提高了对菌载量少的标本的检出率[11-13]。已有研究表明荧光染色法较乳酸酚棉蓝染色法易于观察马拉色菌的真菌结构及出芽模式，更能真实准确地反映马拉色菌在皮肤原位的定植情况[14]。

马拉色菌具有嗜脂性，好定植于头颈部等皮脂溢出部位，Sugita等[15]对从AD患者皮肤鳞屑中提取的马拉色菌DNA进行定量PCR检测，结果显示AD患者头颈部的马拉色菌菌量是四肢的6.8倍，本研究结果也显示AD患者、健康对照者面部马拉色菌密度明显高于上肢。本研究还显示AD患者各部位马拉色菌密度均高于健康对照者相应区域，我们推测可能的原因如下：AD患者普遍存在皮肤屏障功能障碍，定植于皮肤表面的马拉色菌容易进入体内，然后通过特异性IgE抗体和T细胞介导的免疫反应释放炎性介质，这些炎性介质不仅可使局部炎症加重引起瘙痒、搔抓，破坏皮肤屏障功能，还能影响与皮肤屏障功能有关的丝聚蛋白和神经酰胺的合成[16-17]，抑制皮肤表面具有抵御病原微生物活性的抗菌肽合成[18]，上述效应都更加有利于马拉色菌的定植和入侵，形成恶性循环，导致AD患者各部位马拉色菌菌量高于正常人相应区域。此外，有研究表明AD患者皮损区和非皮损区皮肤屏障功能、皮肤表面pH值、皮脂含量等与马拉色菌定植难易程度有关的生理参数无显著差异[19-20]，提示皮损区和非皮损区的马拉色菌菌量可能也无明显差异。

目前关于AD患者皮肤马拉色菌菌量与疾病严重程度关系的研究结果存在差异。Kaga等[21]研究结果显示重度AD患者头颈部皮损区马拉色菌菌量是轻中度患者和健康对照者的2～5倍。Akaza等[22]研究结果显示中重度女性患者面部马拉色菌菌量多于轻度患者，但女性躯干上部和男性面部、躯干上部马拉色菌菌量与病情严重程度无关。既往有研究表明AD患者血清中抗马拉色菌特异性IgE抗体水平明显高于健康对照者，而且与病情严重程度呈正相关[23-24]，提示AD患者病情严重程度与进入体内引起免疫反应的马拉色菌菌量有关，而进入体内马拉色菌的多少不仅由皮肤表面马拉色菌菌量高低来决定的，皮损的性质、皮肤屏障功能受损程度、局部免疫反应也可能对马拉色菌入侵的难易程度有影响。此外，AD患者虽然存在皮肤屏障功能受损等有利于马拉色菌定植的因素，但也有不利因素，例如皮脂含量与疾病严重程度呈负相关[25-27]，随着病情严重程度增加，皮脂含量的下降不利于马拉色菌的定植。

綜上所述，皮肤表面定植的马拉色菌可能仅仅是AD发病的启动因素之一，患者的病情严重程度受多种与马拉色菌定植和入侵有关因素的影响，与皮肤表面马拉色菌菌量相关性尚不明确。

[参考文献]

[1] Bjerre RD，Bandier J，Skov L，et al. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis：a systematic review [J]. Br J Dermatol，2017，177（5）：1272-1278.

[2] Heratizadeh A，Werfel T，Rosner LM. Adaptive immune response and associated trigger factors in atopic dermatitis [J]. Hautarzt，2015，66（2）：96-102.

[3] Jagielski T，Rup E，Ziolkowska A，et al. Distribution of Mal-assezia species on the skin of patients with atopic dermatitis， psoriasis，and healthy volunteers assessed by conventional and molecular identification methods [J]. BMC Dermatol，2014，14（1）：3.

[4] Prohic A，Jovovic ST，Kuskunovic-Vlahovljak S，et al. Distribution of Malassezia Species in Patients with Different Dermatological Disorders and Healthy Individuals [J]. Acta Dermatovenerol Croat，2016，24（4）：274-281.

[5] Leshem YA，Hajar T，Hanifin JM，et al. What the Eczema Area and Severity Index score tells us about the severity of atopic dermatitis： an interpretability study [J]. Br J Dermatol，2015，172（5）：1353-1357.

[6] 赵辨.中国临床皮肤病学[M].2版.南京：江苏凤凰科学技术出版社，2017：772.

[7] Conti Diaz IA，Civila E，Veiga R. The importance of microscopic examination in the management of desquamative diseases of the scalp [J]. Mycopathologia，2002，153（2）：71-75.

[8] 董兴军，张春亭，胡爱萍.糠秕马拉色菌直接镜检的方法学选择[J].皮肤性病诊疗学杂志，2014，21（6）：473-477.

[9] 吴海虹，林家坤，李运华，等.萍乡地区AD流行病学调查及CD4～+CD25～+T细胞在AD发病作用的探讨[J].中国当代医药，2016，23（32）：139-141.

[10] 徐明，张弘，邓劲松，等.马拉色菌显微镜检查的方法学比较[J].福建医药杂志，2011，33（1）：70-72.

[11] 韩德忞，刘原志，朱均昊，等.荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较[J].中国真菌学杂志，2016，11（4）：240-242.

[12] 罗云鹏，高仰敏，金云，等.特敏增强荧光染色法在浅部真菌病诊断中的应用[J].临床检验杂志，2017，35（10）：736-738.

[13] 陈锐君，佟韬，李超，等.荧光染色法和KOH湿片法在诊断浅部真菌感染中的效果比较[J].中国真菌学杂志，2016，11（6）：378-380.

[14] Ramos L，Mellado S，Ramadan S，et al. The use of calcofluor white for studying Malassezia species by direct microscopy [J]. Rev Argent Microbiol，2006，38（1）：4-8.

[15] Sugita T，Tajima M，Tsubuku H，et al. Quantitative analysis of cutaneous Malassezia in atopic dermatitis patients using real-time PCR [J]. Microbiol Immunol，2006，50（7）：549-552.

[16] Rerknimitr P，Otsuka A，Nakashima C，et al. The etiopathogenesis of atopic dermatitis： barrier disruption，immunological derangement，and pruritus [J]. Inflamm Regen，2017， 37（1）：14.

[17] Koppes SA，Brans R，Ljubojevic HS，et al. Stratum Corneum Tape Stripping：Monitoring of Inflammatory Mediators in Atopic Dermatitis Patients Using Topical Therapy [J]. Int Arch Allergy Immunol，2016，170（3）：187-193.

[18] Schmid-Grendelmeier P，Ballmer-Weber BK. Atopic dermatitis-current insights into path physiology and management [J]. Ther Umsch，2010，67（4）：175-185.

[19] Eberlein-Konig B，Schafer T，Huss-Marp J，et al. Skin surface pH，stratum corneum hydration，trans-epidermal water loss and skin roughness related to atopic eczema and skin dryness in a population of primary school children [J]. Acta Derm Venereol，2000，80（3）：188-191.

[20] Choi MJ，Maibach HI. Role of ceramides in barrier function of healthy and diseased skin[J]. Am J Clin Dermatol，2005，6（4）：215-223.

[21] Kaga M，Sugita T，Nishikawa A，et al. Molecular analysis of the cutaneous Malassezia microbiota from the skin of patients with atopic dermatitis of different severities [J]. Mycoses，2011，54（4）：e24-e28.

[22] Akaza N，Akamatsu H，Sasaki Y，et al. Cutaneous Malassezia microbiota in atopic dermatitis patients differ by gender and body part [J]. Dermatology，2010，221（3）：253-260.

[23] Glatz M，Bosshard PP，Hoetzenecker W，et al. The Role of Malassezia spp. in Atopic Dermatitis [J]. J Clin Med，2015，4（6）：1217-1228.

[24] Glatz M，Buchner M，Von BW，et al. Malassezia spp.-specific immunoglobulin E level is a marker for severity of atopic dermatitis in adults [J]. Acta Derm Venereol，2015， 95（2）：191-196.

[25] Holleran WM，Takagi Y，Uchida Y. Epidermal sphingolipids：metabolism， function， and roles in skin disorders [J]. FEBS Lett，2006，580（23）：5456-5466.

[26] 余昊，張伟.特应性皮炎患者血清总IgE、过敏原特异性IgE、嗜酸性粒细胞检测的临床意义[J].中国医药科学，2018，8（1）：136-138，148.

[27] 余剑兰，李志坚，王佳.伊曲康唑联合制霉菌素片治疗复发性糠秕孢子毛囊炎疗效观察[J].中国医药科学，2018，8（7）：93-95，162.

（收稿日期：2018-03-01 本文编辑：金 虹）