甲硝唑氯化钠注射液无菌检查方法适用性试验

夏天 崔迎 李宏铎

[摘要] 目的 按照《中国药典》2015版四部无菌检查法（通则1101）对甲硝唑氯化钠注射液进行无菌检查方法适用性试验，建立优化的甲硝唑氯化钠注射液无菌检查方法。 方法 试验采用薄膜过滤法，以0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，每膜冲洗量从100 mL开始递增，最大冲洗量为每膜1000 mL，分别进行3次试验，第1次使用冲洗液直接冲洗样品，第2次使用含0.13%聚山梨酯80的冲洗液，第3次使用含0.2%聚山梨酯80的冲洗液。 结果 试验一：生孢梭菌试验组均不生长；试验二：当冲洗量达到最大值（每膜1000 mL）时，试验组生长良好；试验三：当冲洗量达到每膜500 mL时，可消除甲硝唑的抑菌性，试验组生长良好。 结论 甲硝唑氯化钠注射液（100 mL：甲硝唑0.5 g与氯化钠0.8 g）可采用薄膜过滤法（每滤筒10瓶供试品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，冲洗5次，每膜100 mL/次）进行无菌检查，以生孢梭菌作为阳性对照菌。

[关键词] 甲硝唑氯化钠注射液；无菌检查；适用性试验；聚山梨酯80

[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（c）-0121-05

[Abstract] Objective To establish optimized sterility test method of Metronidazole and Sodium Chloride Injection according to the suitability test of sterility test for Metronidazole and Sodium Chloride Injection by the sterility test method （general rule 1101） in Chinese Pharmacopoeia （2015）. Methods The test applied membrane filtration method and used 0.1% sterile peptone solution as rinse solution. The rinsing amount of per membrane was increased from 100 mL to the maximum amount of 1000 mL per membrane. Three separate tests were performed. The sample was directly rinsed with the rinse solution for the first time， the rinse solution containing 0.13% and 0.2% polysorbate 80 were used for the second and third time respectively. Results In test one， the Clostridium sporogenes test group did not grow； in test two， the test group grew well when the rinsing amount reached the maximum （1000 mL per membrane）； in test three， the antibacterial effect of Metronidazole could be eliminated and the test group grew well when the rinsing amount reached 500 mL per membrane. Conclusion Metronidazole Sodium Chloride Injection （100 mL： Metronidazole 0.5 g and Sodium Chloride 0.8 g） should be sterilized by membrane filtration （10 bottles for each filter cartridge， 0.1% sterile peptone solution containing 0.2% polysorbate 80 as the rinse solution， rinsed for 5 times， 100 mL/time per film）， using Clostridium sporogenes as a positive control.

[Key words] Metronidazole and Sodium Chloride Injection； Sterility test； Suitability test； Polysorbate 80

甲硝唑氯化鈉注射液主要用于治疗或预防部分厌氧菌引起的系统或局部感染[1]。甲硝唑是一种硝基咪唑的衍生物，能抑制阿米巴原虫氧化还原反应[2]，且杀灭滴虫作用极强，同时对大多数厌氧菌有抗菌作用，而对需氧菌和兼性厌氧菌无作用[3]。因此，必须有效地消除其对厌氧菌的抑制作用，才能建立甲硝唑氯化钠注射液的无菌检查方法，从而检出样品中可能存在的其他微生物。聚山梨酯80是一种亲水型非离子表面活性剂[4]，在药品微生物限度检查中常被用作中和剂，而在无菌检查中被用在稀释液或冲洗液中作为增溶剂[5]。通过调节其在溶液中的浓度，可以增加药物的溶解度[6]，减少无菌培养器内的药物残留，消除样品对阳性菌的抑菌作用，建立适宜的无菌检查方法[7]。本试验依照《中国药典》2015版四部无菌检查法（通则1101）中的规定进行无菌检查方法适用性试验[8]，建立甲硝唑氯化钠注射液无菌检查方法。

1 仪器与材料

本试验的供试品为甲硝唑氯化钠注射液（西安京西双鹤药业有限公司，批号：1701222A，1702041G，1703102A，规格100 mL：甲硝唑0.5 g与氯化钠0.8 g）。本实验室环境符合《中国药典》2015版四部药品微生物实验室质量管理指导原则（通则9203）和药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9205）中的相关规定[8]。主要仪器有生物安全柜[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：THERMO1378]，灭菌器[TOMY（日本）公司，型号：SX-500]，集菌仪（Merk Milipore，型号：SYMBLFH03）。试验所用菌种分别为枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，以上菌种均由中国食品药品检定研究院提供[9]。试验所用培养基、稀释液和冲洗液全部按照《中国药典》2015年版四部无菌检查法（通则1101）中的要求配制[8]，均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产。试验用试剂为聚山梨酯80（批号：20140422）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

按照《中国药典》2015年版四部无菌检查法（通则1101）[8]，方法适用性试验中菌种及菌液制备的要求，将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色念珠菌分别制成菌数（孢子数）小于100 cfu/mL的菌（孢子）悬液。各菌液浓度计数结果见表1。

2.2 方法适用性试验一

取同批次供试品，每滤筒10瓶供试品，以无菌操作消毒处理、备用[10]。采用薄膜过滤法，以0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，分别冲洗1、2、3、5、10次，每次100 mL/膜，同时在最后1次冲洗液中，分别加入上述“2.1”中制备的小于100 cfu的各试验菌菌液，过滤完之后，再加入相应的100 mL培养基置滤筒内，按规定温度培养，逐日观察，培养时间不得超过5 d，作为试验组。另外将装有等量培养基的滤筒，加入上述各试验菌，作为对照组。再取同批次供试品60瓶，同法操作，不加试验菌，作为供试品对照组；最后取冲洗液，同法操作，不加试验菌，作为阴性对照。从表2中可以看出，3批供试品的试验组与对照组比较，除生孢梭菌试验组未生长外，其他菌种在规定时间内均可正常生长，说明供试品中仍有甲硝唑成分残留，抑制了生孢梭菌生长。应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法重新进行方法适用性试验。本试验将采用含一定浓度聚山梨酯80的0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，在不影响微生物生长的前提下，消除样品中的抑菌成分。

2.3 聚山梨酯80浓度的确定

聚山梨酯80是表面活性剂的一种，表面活性剂的分子具有两亲结构，当表面活性剂达到一定浓度时，亲水基团和疏水基团在溶液中将会出现平衡状态[11]，此时溶液表面张力开始下降，若继续增加表面活性剂的浓度，样品溶液中的表面活性剂分子就会形成聚集体，称之为“胶束”，从而增加药物的溶解度[12]。把开始形成胶束时的表面活性剂的浓度称之为临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）[13]。因此要确定聚山梨酯80的使用量，首先要知道其CMC值。通过查阅文献资料，得知聚山梨酯80的CMC值为1.4×10-2 g/L（25℃下）[14]，再经过换算得到本次实验所用的聚山梨酯80的浓度为0.13%（mL/100 mL），故将其确定为冲洗液中聚山梨酯80的使用浓度。

2.4 方法适用性试验二

采用薄膜过滤法，取同批次供试品，按每滤筒10瓶供试品，以含0.13%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液为冲洗液，分别冲洗2、4、6、8、10次，每膜100 mL/次。再加入相应的100 mL培养基置滤筒内，按规定温度培养，逐日观察，培养3～5 d。试验组、菌液对照组与阴性对照组试验操作同方法适用性试验一，仅冲洗量按照上述操作。从表3中看出，以含0.13%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液作为冲洗液，当冲洗量达到《中国药典》规定的最大值（冲洗量不得超过1000 mL/膜）[8]，才能够消除供试品中甲硝唑的抑菌性，说明聚山梨酯80的浓度在CMC值时虽然可以增溶甲硝唑，但大量的冲洗难免造成微生物菌体的损伤，易出现假阴性结果，而且还会影响滤膜的孔径[15]，加之耗时长，操作繁复，该方法并不适宜作为最终甲硝唑氯化钠注射液的无菌检查方法[16]。若继续增加聚山梨酯80的用量，可在消除样品中残留甲硝唑成分的同时减少冲洗量，建立优化的无菌检查方法。

2.5 方法适用性试验三

使用薄膜过滤法，取同批次供试品，按每滤筒10瓶供试品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液为冲洗液，分别冲洗1、2、3、4、5次，100 mL/次。再加入相应的100 mL培养基置滤筒内，按规定温度培养，逐日观察，培养3～5 d。试验组、菌液对照组与阴性对照组试验操作同方法适用性试验一，仅冲洗量按照上述操作。结果见表4。方法适用性试验三的结果表明，当冲洗量达到500 mL/膜时，与对照组比较，含供试品各试验组的试验菌均生长良好，因此该方法可作为甲硝唑氯化钠注射液的无菌检查方法。

3 讨论

聚山梨酯80是一种增溶剂，属于亲水性非离子表面活性剂，其化学结构有较长的碳链，对含亲脂性基团的药物有良好的助溶作用，且常用作稳定剂保护药品的稳定性。甲硝唑含有R1位亲脂基团，微溶于水，聚山梨酯80与甲硝唑结合后，增加了甲硝唑在溶液中的溶解度，再调整冲洗量将残留的甲硝唑彻底冲洗干净，以达到消除其抑制厌氧菌的作用。溶液达到临界胶束浓度时，若继续提高聚山梨酯80浓度，会有大量胶团形成，而多余的聚山梨酯80在甲硝唑分子结构外会包裹一层水化膜，不仅能有效地阻止甲硝唑分子之间互相接触，使溶液能迅速通过滤膜[17]，同时也会降低细菌菌体与培养基接触面之间的表面张力，使外围营养物质更快地进入菌体细胞内，促进细菌快速生长[18]。因此，聚山梨酯80的浓度应达到或者稍大于CMC值。

本试验分别采用三种冲洗液：0.1%无菌蛋白胨水溶液、含0.13%聚山梨酯80与含0.2%聚山梨酯80的0.1%無菌蛋白胨水溶液，在不影响微生物生长的前提下可消除样品中的抑菌成分。试验结果表明，以0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，即使冲洗量达到药典规定的最大限制每膜1000 mL，仍不能消除样品中甲硝唑的抑菌性，这与其他文献中的结果稍有出入[19]，并不代表试验结果不可信，可能是试验条件不同与供试品不同所导致的；含0.13%聚山梨酯80的0.1%无菌蛋白胨水溶液，在冲洗量达到1000 mL/膜时，才能中和供试品中的抑菌成分；用含0.2%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液为冲洗液，当冲洗量达到500 mL/膜时，生孢梭菌即生长良好，符合《中国药典》2015年版四部通则1101无菌检查法的要求[8]。试验二与试验三的结果正好验证了上述结论，即聚山梨酯80的浓度应达到或稍大于CMC值。值得关注的一点是，在甲硝唑氯化钠注射液无菌检查试验中，硫乙醇酸盐流体作为培养基，培养生孢梭菌时要注意培养时间的控制，培养至18 h时，生孢梭菌生长旺盛，呈单个典型的伞状菌落，未出现融合与扩散现象，便于观察和计数。培养时间继续增加，菌落会呈现大片融合状态[20]，不利于观察。

本次方法适用性试验提示，甲硝唑是一种能够有效抑制厌氧菌的药物，考虑到冲洗量较大会损伤微生物，以及检出阳性的可能性降低，最终确定甲硝唑氯化钠注射液（100 mL：甲硝唑0.5 g与氯化钠0.8 g）可采用薄膜过滤法（每滤筒取10瓶供试品，以含0.2%聚山梨酯80的0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，冲洗5次，100 mL/次）进行无菌检查，以生孢梭菌作为阳性对照菌。

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