纳米磁珠技术相关毒理实验研究

王欣 张黎明

[摘要] 目的 研究納米磁珠相关毒理，了解其在大鼠体内分布代谢情况。 方法 选取24只健康成年大鼠随机分为8组，每组3只，一组未做任何处理作为空白对照组，一组注射生理盐水作为阳性对照组，其余6组注射纳米氧化铁磁珠作为实验组。观察各组大鼠生长发育情况、行为学及神经功能改变情况。采用HE染色及普鲁士蓝染色观察实验组大鼠脏器结构是否改变，是否造成局部炎性反应等病理性改变及磁珠在动物主要脏器中的分布情况。另选取10只大鼠随机分为两组，每组5只，分别注射氧化铁磁珠和生理盐水，通过水迷宫实验观察大鼠认知功能。另取4只健康新西兰家兔，观察注射氧化铁磁珠后血清学相关指标的变化情况。 结果 实验组大鼠与空白对照组均未见生长、外观异常表现；Longa评分均为0分，未见异常变化。水迷宫实验逃避潜伏期和穿越平台次数评分组间差异无统计学意义（P > 0.05）。各实验组大鼠脏器形态未见结构及病理改变，氧化铁磁珠在注入大鼠体内5 min后已经离开循环系统进入各种脏器，磁珠大部分分布在脾脏及肝脏。与未注射氧化铁磁珠的家兔相比，注射65 d后家兔肌酐值增加，差异有统计学意义（P < 0.05），但肌酐值仍在家兔血液化验指标正常范围内。其他血清生化指标、铁系列指标及血常规指标比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 纳米磁珠技术在大鼠和家兔体内未见明显毒理反应，但纳米磁珠技术相关毒理仍有待进一步探究。

[关键词] 纳米磁珠；毒理研究；体内分布

[中图分类号] R916.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（c）-0009-05

[Abstract] Objective To study the toxicology of nanomagnetic beads and to understand the distribution of metabolism in rats. Methods Twenty-four healthy adult rats were randomly divided into 8 groups with 3 rats in each group. One group without any treatment as a blank control group， one group was injected with normal saline as positive control group， the other 6 groups were injected with nano-oxidized iron magnetic beads as the experimental group， the growth， behavior and neurological changes of the rats of each group were observed. HE staining and Prussian blue iron staining were used to observe the changes of organ structure and local pathological changes such as inflammatory reaction of rats in the experimental groups， and the distribution of magnetic beads in the main organs of the rats. Ten rats were randomly divided into two groups， and with 5 rats in each group， rats in the two groups were injected with ferromagnetic beads or normal saline respectively， and the cognitive function of rats was observed. Blood of 4 healthy New Zealand rabbits were collected after the injection of iron oxide magnetic beads and changes of related indexes were observed. Results There was no abnormal growth or appearance in the experimental group and the blank control group. The Longa score was 0， no abnormal changes were observed. Water maze experiments of the two groups including the escape latency and the number of crossing platforms were scored， there was no statistically significant （P > 0.05）. There were no structural and pathological changes in the organ morphology of the rats in each group. The iron oxide magnetic beads had left the circulatory system and entered various organs of the rats after being injected for 5 minutes. Most of the magnetic beads were distributed in the spleen and liver. The difference in creatinine levels at different time points after injecting iron oxide magnetic beads in rabbits was statistically significant （P < 0.05）， but still in the normal range. Other serum biochemical indicators， iron series indicators and blood routine indicators were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion There is no obvious toxicological reaction by nanomagnetic beads. The toxicology related to nanomagnetic beads remain to be further explored.

[Key words] Nonomagnetic beads； Toxicological studies； Tissue distribution

急性脑梗死是常见的脑血管病变之一，具有高致死、致残风险，且近年来有研究表明，急性脑梗死发病率不仅逐年上升，并有年轻化趋势[1-2]。当前急性脑梗死的临床治疗仍以药物治疗为主，但受梗死时间窗、出血风险、药物费用等因素制约，仍未能取得极满意疗效。纳米磁珠技术是纳米微粒与磁控技术的结合，可通过磁场控制纳米微粒运动，而运动和旋转的纳米微粒产生的机械力不仅可洗刷血栓，达到清除或减小血栓以恢复梗死区域血供的目的，并具药物载体功能。基于理论基础，其用于急性脑梗死具一定可行性[3-4]。但纳米磁珠技术相关毒理研究尚有缺失[5]，本研究以此为方向，旨在进一步补充及完善纳米磁珠技术的临床应用，具体报道如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取34只健康成年SD大鼠（北京华阜生物科技，许可证号：SCXK京2014-0004），雌雄参半，体重240～250 g，5～7周龄。大鼠均健康状态良好，食欲旺盛，眼睛有神，反应敏捷，无弯尾，体无伤痕，天然空腔未见分泌物，无畸形，粪便黑色，呈麦粒状。大鼠生存环境：温度21.3～22.7℃，湿度51.87%～55.0%。

另选取4只健康新西兰白色家兔（上海生旺实验动物养殖有限公司，许可证号SCXK沪2007-0007），雌雄参半，体重（2.09±0.15）kg，生存环境：16～26℃，湿度40%～70%。

所有实验动物均自由摄取食物，所有食物均经高压蒸汽灭菌，垫料及过滤水更换频率为2 d/次。

1.2 实验方法

1.2.1 取24只大鼠随机分为8组，每组3只大鼠，随机取一组不做处置作为空白对照组；一组大鼠注射生理盐水，总剂量为大鼠血容量的5%，作为阳性对照组；其余6组大鼠作为实验组经尾静脉注射浓度为5 mg/mL氧化铁磁珠，总剂量为大鼠血容量的5%。随后观察各组大鼠外观，记录空白对照组、阳性对照组以及实验组注射后5 min、30 min、7 d、35 d、65 d、100 d时分别行Longa功能评分[6]，该评分法将大鼠神经学检查按0～4分分为5个等级，依次对应正常、无神经功能缺损；左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；不能自发行走、有意识丧失。分值与神经功能缺损程度呈正相关。空白对照组及注射后5 min、注射后30 min、注射后7 d、注射后35 d、注射后65 d、注射后100 d的实验组大鼠分别处死，取主要脏器，包括脑、心、肺、肝、脾、肾脏等，先观察主要脏器大体形状、表面色泽、质地等。在每个脏器取大小为1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织，采用4%中性甲醛溶液固定并制备常规石蜡切片，对脏器组织做HE染色，通过光学显微镜进行病理学观察，观察实验动物脏器结构是否改变、是否造成局部炎性反应等病理性改变。取大小为1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织，采用普鲁士蓝染色法显微镜下观察磁珠在大鼠脑、心、肺、肝、脾、肾脏等主要脏器中的分布情况。染色采用伊红法，亚铁氰化钾和盐酸按比例配置Perls染液，现用现配，依次脱蜡、染色、伊红复染、脱水、中性树胶封片。

1.2.2 取10只大鼠，雌雄参半，随机分为两组，分别经尾静脉注射浓度为5 mg/mL氧化铁磁珠和生理盐水，剂量同为大鼠血容量的5%。注药120 d后，10只大鼠进行水迷宫实验[7]。 Morris水迷宫平台藏于水面下1～2 cm处，水温（22±2）℃，水中加墨汁，水池壁分别等分为4个象限并进行标记，选取第三象限正中位置放入平台迷宫外参照物保持固定，分别对大鼠进行5 d的定位航行试验和1 d空间探索试验，记录逃避潜伏期和穿越平台次数。

1.2.3 取4只家兔，均经耳缘静脉注射浓度为5 mg/mL的氧化铁磁珠，注射剂量为家兔血容量的5%，分别于注射前、注射后7 d、注射后65 d时采集家兔耳静脉血，3000 r/min离心10～15 min（离心半径13.5 cm，离心温度4℃），取血清，使用日本东亚SP-3000血细胞分析仪进行血常规检测，日本Olympus公司5400全自动生化分析仪检测生化指标，检测指标包括：①生化指标，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、钾（K）、钠（Na）、总胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）；②铁系列指标，包括血清铁、铁蛋白、总铁结合力；③血常规化验指标，包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、血细胞比容（Hct）、平均红细胞血红蛋白体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、血小板（PLT）计数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素F方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠外观及行为学改变情况

空白对照组与实验组大鼠均未见异常生长，无大鼠死亡事件发生，皮毛、色泽正常，饮食、粪便颜色及性质、呼吸均未见明显异常，体重均有增加，注射前及注射后不同时间点各组大鼠活动量、反应能力等均未出现明显异常，Longa评分均为0分，未见异常变化，且两组水迷宫实验逃避潜伏期和穿越平台次数评分组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 大鼠体内磁珠病理性改变及分布情况

各组大鼠脏器形态未见明显改变，形态正常，脏器表面光滑。经HE染色显微镜下可见各脏器结构完整，脏器细胞排列整齐，形态规则，未见局部炎性反应；經普鲁士蓝染色，氧化铁磁珠在注入大鼠体内5 min后已经离开循环系统进入各种脏器，磁珠大部分分布在脾脏及肝脏，少量磁珠分布在肺脏，仅极少量磁珠分布在脑组织。磁珠在实验大鼠体内7 d时，主要脏器中沉积量达到高峰，35 d时脏器内沉积的磁珠量减少，65 d时磁珠在体内仍有残留，100 d时脏器内磁珠残留明显减少。见图1～4。

2.3 家兔体内注射氧化铁磁珠后生化指标变化情况

较注射前，家兔体内注射氧化铁磁珠7 d及65 d后，ALT、AST、BUN、K、Na、CHOL、TG等指标水平差异无统计学意义（P > 0.05），Cr则随在不同时间点有上升趋势，差异有统计学意义（P < 0.05），但肌酐值仍在家兔血液化验指标正常范围内。见表2。

2.4 家兔体内注射氧化铁磁珠后铁系列指标变化情况

与注射前比较，家兔体内注射氧化铁磁珠7 d后血清铁、铁蛋白、总铁结合力等铁系列指标水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

2.5 家兔体内注射氧化铁磁珠后血常规化验值变化情况

较注射前，家兔体内注射氧化铁磁珠7 d及65 d后，WBC、RBC、Hb、Hct、MCV、MCH、PLT等指标水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3 讨论

纳米材料具有體积小、表面积高等特点，并且在传导性、反应性、光敏性上均表现出独特优势。随着现代社会对纳米材料的研究日渐深入，纳米氧化铁磁珠在生物医学领域得以飞速发展，被应用于MRI对比剂、药物载体、生物分子探针等多个领域，并在恶性肿瘤的临床诊治中发挥了重要价值。而氧化铁作为磁性纳米粒子之一，不仅有纳米材料的表面效应、尺寸效应、量子效应及宏观量子隧道效应，同时还具优势耐光性、抗腐蚀性及稳定性，氧化铁磁珠还合并磁响应性、超顺磁性，并有类酶催化性、生物相容性[8-9]。陈龙华[10]通过磁共振成像观察超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞在脑梗死大鼠脑内的迁徙及分布时指出，经超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植后可通过磁共振对其在大鼠脑内迁徙及分布情况进行观察；王海龙等[11]也报道将超顺磁性氧化铁作为示踪剂，用于标记细胞可在细胞移植机制、治疗效果的探索上发挥重要价值。随着其应用范围日渐广阔，毒理安全性也应被重视。

既往有研究表明，纳米氧化铁进入体内后经网状内皮系统摄取，随血液循环到达肝脏、脾脏等器官，经由肾脏排泄，也有一部分经红细胞代谢后进入正常血浆铁池，参与血红蛋白、肌红蛋白等合成，并影响能量代谢及造血功能[12-13]。而本研究亦显示，注射磁珠后实验大鼠正常生长、皮毛色泽等外观及行为学能力未见明显改变，磁珠主要在脾脏、肝脏中沉积，也有部分沉积在肺脏中，只有极少量磁珠分布在脑、心、肾脏中。磁珠在实验大鼠体内7 d时，主要脏器中沉积量达到高峰，35 d时脏器内沉积的磁珠量减少，65 d时磁珠在体内仍有残留，100 d时脏器内磁珠残留明显减少；且注射磁珠后实验动物脏器大体及镜下无明显病理性改变，提示大粒径磁珠未对动物生长、外观、行为学能力造成明显影响，对动物主要脏器结构功能均未造成明显改变，并未在组织脏器中产生明显局部炎性反应。同时，研究还显示，注射磁珠后7 d时家兔血液生化指标、铁系列指标、血常规化验指标与注射磁珠前化验结果无明显差异，仅注射磁珠后65 d时家兔Cr与注射磁珠前化验结果存在统计学差异，但肌酐值仍在家兔血液化验指标正常范围内，这与既往报道相符[14-15]。

本研究也存一定局限性，如未针对不同给药途径、暴露途径、表面修饰物的氧化铁磁珠进行毒理研究，未制备急性脑梗死模型，且本研究为动物体内实验，还需进一步研究氧化铁磁珠在人体内的相关毒性[16-18]，综合本研究结论，纳米磁珠技术的毒理研究仍有极大深入探究空间[19-20]。

综上所述，动物实验可见，未见经静脉注射氧化铁磁珠对动物生长、外观、行为学能力及神经功能造成明显影响，对动物主要脏器结构功能均未造成明显改变，并未在组织脏器中产生明显局部炎性反应，血清相关指标也未见面明显影响。

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（收稿日期：2018-05-10 本文编辑：任 念）