结核感染T细胞斑点试验对使用免疫抑制剂患者 并发肺结核的诊断价值

谭毅刚 李嫣红 郑闽莉

由于器官移植、肿瘤、结缔组织疾病等需接受免疫抑制药物治疗患者的免疫功能降低，导致免疫损害宿主(immunocompromised host，ICH)易并发结核感染。相关文献报道，ICH并发肺结核患者的临床表现及影像学特征与普通细菌感染相似，影像学分析及结核菌素纯蛋白衍生物试验(简称“PPD试验”)对诊断结核病差异明显，极易漏诊和误诊[1-3]。近年来，以T细胞免疫为基础的体外γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assays，IGRA)成为结核病免疫诊断技术的重要突破，其中结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)成为具有较好特异度和敏感度的重要检测手段[4]。然而其在需要采用免疫抑制剂治疗的患者并发结核病时的检测效果少见报道，故笔者尝试分析此类患者采用血T-SPOT.TB检测对结核病的诊断价值。

对象和方法

一、研究对象的来源和分组

回顾性收集广州市胸科医院2013年7月至2015年12月收治的因基础疾病使用免疫抑制剂(如糖皮质激素、细胞毒药物等)治疗6个月以上，且并发肺结核的初治患者197例(简称“观察组”)；收集同期200例未使用免疫抑制剂的初治肺结核患者(简称“对照组”；与观察组患者为相邻住院号的患者，若相邻住院号患者不符合入选标准，则顺延住院号选择患者)的临床资料。所有患者外周血检测的CD3+、CD4+T淋巴细胞绝对值计数均低于正常数值下限。

观察组患者中，男107例(54.3%)，女90例(45.7%)；年龄15～84岁，平均年龄(43.0±15.2)岁；基础疾病包括肾移植者44例、肾病综合征41例、类风湿性关节炎40例、系统性红斑狼疮72例。对照组患者中，男126例(63.0%)，女74例(37.0%)；年龄18～81岁，平均年龄(45.5±17.6)岁。两组患者均排除患有糖尿病、肿瘤、HIV感染等其他疾病，同时均排除确诊为耐多药结核病的患者。

二、肺结核诊断标准[5]

通过痰液或支气管灌洗液(BALF)的涂片或培养查找抗酸杆菌，对阳性菌株行菌种鉴定以排除非结核分枝杆菌，结合胸部X线摄影检查符合活动性肺结核表现；菌阴肺结核诊断标准见文献[5]。

三、检测方法

1．外周血T-SPOT.TB检测方法及结果判定：选用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英国)试剂盒，从外周静脉血中分离出单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每个预包被抗γ干扰素抗体的孔中加入2.5×105个PBMC，分别与两种抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，使用酶联免疫斑点(ELISPOT)读板仪对斑点进行计数。

阳性判断标准：(1)如果空白对照孔斑点数<6个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数>6；(2)如果空白对照孔斑点数≥6个，检测孔斑点数必须>2倍的空白对照孔斑点数。反之，为阴性结果。阴性或阳性对照异常，试验均视为无效。

2．抗酸杆菌金胺O荧光染色涂片镜检(简称“金胺O涂片镜检”)：用接种环挑取痰液或支气管灌洗液中干酪样脓样或带血小块，制成厚涂片，自然干燥，染色前火焰固定。将制好的涂片用金胺O溶液染色，加温促使菌体着色，3%盐酸乙醇脱色，然后用高锰酸钾溶液复染，置含有紫外光源的荧光显微镜下检查，抗酸杆菌会发出闪亮的橘黄色，则为阳性。

3．结核分枝杆菌快速液体培养及菌种鉴定：结核分枝杆菌培养操作程序严格按照中国防痨协会基础专业委员会编著的《结核病诊断实验室检验规程》[6]要求进行，采用BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)系统对结核分枝杆菌进行分离培养和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，以对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)鉴别培养基初步菌株鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非结核分枝杆菌。

4．PPD试验：所有研究对象在采血后，使用Mantoux法在前臂皮内注射PPD 0.1 ml(5 IU)，72 h 检测反应结果，用直尺量取硬结平均直径并记录。若硬结平均直径≥5 mm为阳性，≥15 mm为强阳性，以红肿硬结平均直径≥15 mm作为判断是否感染结核分枝杆菌的标准。

四、统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

观察组临床确诊的197例患者中，外周血T-SPOT.TB检测阳性为168例，阴性为29例，即阳性率和敏感度均为85.28%；分泌物金胺O涂片镜检找分枝杆菌阳性为72例，阴性为125例；分泌物分枝杆菌MGIT 960培养阳性106例，经菌种鉴定均为结核分枝杆菌；PPD试验阳性者68例，阴性者129例。对照组临床确诊的200例患者中，外周血T-SPOT.TB检测阳性为192例，阴性为8例；分泌物金胺O涂片镜检找分枝杆菌阳性为71例，阴性为129例；分泌物MGIT 960培养阳性115例，经菌种鉴定均为结核分枝杆菌；PPD试验阳性者127例，阴性者73例。以临床确诊患者为标准，观察组和对照组患者T-SPOT.TB检测阳性率均明显高于金胺O涂片镜检、分泌物MGIT 960培养、PPD试验，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。两组患者间T-SPOT.TB与PPD试验检测差异有统计学意义(P值<0.05)。具体见表1。

讨 论

由于长期使用糖皮质激素等各种免疫抑制剂的患者免疫功能下降，结核感染的发生率远高于普通人群，但其临床表现及肺部影像学检查多不典型，难以及时确诊[7-8]，故笔者回顾性分析各检测方法对需要采用免疫抑制剂治疗的患者并发结核病时的检测效果。

研究结果显示，对照组和观察组患者分泌物涂片及培养的阳性率组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)，提示传统方法检测两组患者结核感染的能力无变化，对是否使用免疫抑制剂的结核病患者诊断价值一致；而在PPD试验检测中，观察组的阳性率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，降低了对免疫抑制患者罹患结核病的诊断作用；有报道认为，PPD试验可检测体内T淋巴细胞的免疫变态反应，当患者服用免疫抑制药物时，可致机体内T淋巴细胞免疫反应受到抑制，同时抑制了细胞的迟发型变态反应，导致PPD皮肤试验阳性率较非免疫受损患者低[9]，故需阳性率更高、检验时间更短的检测方法来辅助诊断。

目前，临床应用的IGRA技术主要有两种：其一是采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunospot assay, ELISA)检测全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放γ干扰素的水平，称为IGRA-ELISA；其二是采用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)测定PBMC中能释放γ干扰素的效应T细胞数量，称为T-SPOT.TB。T-SPOT.TB是以结核分枝杆菌复合群特有的ESAT-6和CFP-10抗原作为特异性抗原，当已结核感染的患者再次接触上述抗原时，患者PBMC中存在的结核特异T淋巴细胞受刺激分泌γ干扰素，通过测定PBMC中释放γ干扰素的效应T细胞数量，判断是否结核感染，对辅助诊断活动性结核病与结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定参考价值。由于ESAT-6和CFP-10在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失，故可以提高T-SPOT.TB对结核病检测的特异度。

表1 两组患者各方法检测的情况及比较

注括号外数值为患者例数，括号内数值为率(%)；a：为组内T-SPOT.TB与各检测方法阳性率进行的比较；b:为两组间各检测方法阳性率的比较

本研究显示，观察组和对照组的血T-SPOT.TB检测的阳性率均明显高于各组内分泌物金胺O涂片镜检及MGIT 960培养、PPD试验，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，与李同心等[10]报道相近。以上两组患者血T-SPOT.TB检测的阳性率高达85.28%～96.00%，均远高于本组传统实验室检测方法的阳性率，提示T-SPOT.TB检测阳性时较其他检测方法有更好的判断意义；同时在未使用免疫抑制剂的结核病患者中，血T-SPOT.TB检测阴性结果对活动性肺结核的排除诊断具有较大意义[11]。

在本研究中，观察组患者T-SPOT.TB阳性率低于对照组患者，差异有统计学意义(P<0.05)；可能与患者服用免疫抑制药物后严重抑制了T淋巴细胞的免疫应答，或与T淋巴细胞数值下降有关，从而降低了观察组的阳性检出率。据Leidl等[12]研究显示，在HIV感染者中，随着免疫状态的降低，T-SPOT.TB检测的假阴性率逐渐增高；另外，Yang等[13]也认为CD4+T淋巴细胞计数对T-SPOT．TB的检测结果起到很重要的作用，其阳性率和CD4+T淋巴细胞计数呈正比，当患者免疫抑制严重时，其T淋巴细胞计数也下降。据钟一鸣等[9]、沈圆兵等[14]在对结缔组织疾病患者的研究中显示，血T-SPOT.TB检测的敏感度仅为70.5%，但对T-SPOT.TB诊断假阴性相关危险因素分析中发现：年龄、糖皮质激素等免疫抑制剂的使用、淋巴细胞减少症和低蛋白均不是T-SPOT.TB诊断假阴性的危险因素。本研究显示，观察组患者血T-SPOT.TB的阳性率较对照组低，其机制尚未完全清晰，有待进行更多的相关研究。本研究观察组患者血T-SPOT.TB检测阴性率达14.72%，提示可能存在LTBI风险；故使用免疫抑制剂患者采用T-SPOT.TB检测阴性时，不能完全排除结核分枝杆菌感染可能，会出现假阴性可能。

国外文献报道，血T-SPOT.TB检测阳性结果与PPD试验阳性结果相同，可诊断患者存在结核感染，但不能区分活动性结核病和LTBI[15-16]；而对于肺部有病灶或疑似结核病患者，国内有较多文献报道认为，此类患者血T-SPOT.TB检测的阳性率可达87.8%～96.0%，敏感度可达86.9%～90.9%[17-18]，与本研究观察组和对照组血T-SPOT.TB检测阳性率(85.28%和96.00%)相一致，可用于活动性结核病的辅助诊断。且T-SPOT.TB检测阳性率高达96.00%，高于本研究其他传统实验室方法的检测阳性率；提示对于既往无结核病病史、近期肺部出现活动性病变而疑似肺结核，并且血T-SPOT.TB检测结果呈阳性的患者，通过鉴别诊断排除普通细菌感染、肿瘤及其他肺部疾病后，可考虑结核感染可能。

志谢广州市胸科医院谭守勇教授对本研究给予了多方面的指导