反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平活性代谢产物的浓度

高雅莉　庄奕筠　许秋霞

[摘要] 目的 建立反相高效液相色谱法测定人血清中奥卡西平（OXC）活性代谢产物MHD的浓度。 方法 收集血清样品经甲醇沉淀蛋白后，采用InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）色谱柱，流动相为甲醇-水（35：65），流速：0.8 mL/min，检测波长：210 nm，柱温：40℃，进样体积：20 μL。 结果 血清中内源性物质对样品测定无干扰，MHD 在4.8～38.4 μg/mL线性关系良好，回归方程为：A=13968.3C-13730.7，r=0.9990。MHD的低、中、高3种浓度平均回收率均>95%，日内、间 RSD 均<3%（n=5）。 结论 反相高效液相色谱法简便、准确、灵敏度高，适用于人体内奥卡西平活性代谢产物MHD的血药浓度监测。

[关键词] 奥卡西平；10，11-二氢-10-羟基卡马西平；活性代谢产物；反相高效液相色谱法；血药浓度

[中图分类号] R969 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）12-0042-03

Determination of active metabolites of oxcarbazepine in human serum by reversed-phase high performance liquid chromatography

GAO Yali ZHUANG Yiyun XU Qiuxia CHEN Xi

Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

[Abstract] Objective To establish reversed-phase high performance liquid chromatography method for the determination of oxcarbazepine（OXC） active metabolite MHD concentration in human serum. Methods The serum samples were collected and the protein was precipitated by methanol， then InertSustain C18（5 μm， 4.6×150 mm） chromatography column was used， and the mobile phase was methanol-water（35：65）， flow rate： 0.8mL/min， detection wavelength： 210 nm， column temperature： 40°C， injection volume： 20 μL. Results The endogenous substances in serum did not interfere with the determination of the samples. The linearity of MHD was good from 4.8 to 38.4 μg/mL. The regression equation was： A=13968.3C-13730.7， r=0.9990. The average recoveries of MHD at low， medium， and high concentrations were all> 95%， and intra-and inter-day RSDs were <3%（n=5）. Conclusion The reversed-phase high performance liquid chromatography method is simple， accurate and sensitive， which is suitable for monitoring the plasma concentration of MHD， an active metabolite of oxcarbazepine.

[Key words] Oxcarbazepine；10， 11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine；Active metabolites； Reversed-phase high performance liquid chromatography；Serum concentration

癫痫是一组由于脑部神经元异常过度放电所引起的突然、短暂、反复发作的中枢神经系统（central nervous system，CNS）功能失常的慢性疾病和綜合征[1]，是一类严重影响人类身心健康的神经系统疾病。目前，癫痫患者控制癫痫发作的最重要手段仍然是服用抗癫痫药物。奥卡西平（oxcarbazepine，OXC）是一种新型的抗癫痫药物，是卡马西平（carbamazepine，CBZ）的10-酮基衍生物（图1），2000年1月由美国FDA批准上市。OXC不良反应的发生率显著低于CBZ[2]，且耐受性好，对肝药酶诱导作用较弱，药物相互作用少，可作为传统抗癫痫药的替代药物[3]。OXC在服用后，迅速且几乎完全地降解为药理活性代谢产物10，11-二氢-10-羟基卡马西平（monohydroxycarbazepine，MHD）（图2）。在人体进行的一项物质平衡研究中，OXC原型仅占血清中总放射活性的2%[4]，因此在临床上可通过测定血清中MHD血药浓度来判断OXC的疗效和不良反应。为了解MHD在体内的药动学特征和进行血药浓度监测，本研究参考国内外相关文献，简化血样前处理，优化色谱条件，建立了RP-HPLC法测定人血清中MHD浓度，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-30AD高效液相色谱系统：包括DGU-20A5R脱气机、SIL-30AC自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-30A柱温箱、LC-30AD二元泵以及LC solution色谱工作站；XH-B型漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；离心机（10900/min，德国ABBOTT公司）；METTLER AE240电子天平。

1.2 试剂与试药

奥卡西平片（商品名为曲莱，Novartis Pharma Schweiz AG，规格300 mg/片）；MHD对照品（南京康满林生物医药科技有限公司，纯度约为96%，批号：20131227）；甲醇（HPLC级，美国TEDIA公司）；纯化水（本实验室自制）；空白血浆（健康体检者的混合血浆）；其他试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：InertSustain C18（5 μm，4.6×150 mm）；流动相：甲醇-水（35：65）；流速：0.8 mL/min；二極管阵列检测器波长：210 nm；柱温：40℃；进样体积：20 μL。

1.3.2 对照品溶剂的配制 精密称取MHD标准品适量放在烧杯中，用少量甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中，用甲醇多次洗涤烧杯，并把洗涤溶液全部转移到容量瓶中，甲醇稀释至刻度，配制成0.96 mg/mL（此浓度经过纯度折算）的标准储备液，转移至棕色瓶后置冰箱4℃贮存。临用时，用甲醇稀释成浓度为96 μg/mL的工作液。

1.3.3 标准血清样品的制备及前处理 分别精密量取96 μg/mL的MHD工作液适量，用甲醇稀释得到含MHD 4.8、9.6、14.4、19.2、28.8、38.4 μg/mL标准工作液。精密移取空白血清200 μL置于1.5 mL EP管中，分别加入200 μL上述已配置好的不同浓度标准工作液，旋涡混匀1 min，加入600 μL甲醇，旋涡混匀1 min，10900 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器滤过，进样上机。

1.3.4 血清样品前处理 精密量取患者血清样品200 μL置于1.5 ml EP管中，加入800 μL甲醇沉淀蛋白，旋涡混匀1 min，10900 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器滤过，进样上机。

2 结果

2.1 方法的专属性

在选定的血样前处理方法和色谱分离条件下，得到空白血清（A）、空白血清加入MHD对照品（B）、患者服药后血样（C）的色谱图见图3。可见在本实验条件下MHD的保留时间为15.25 min，血清中内源性物质对MHD的测定无干扰，色谱峰形较好，分离完全。

2.2 标准曲线的制备

取含MHD的系列标准工作液，按“1.3.3”项下方法操作后，进样测定，记录色谱图。以样品峰面积（A）对质量浓度（C）作线性回归，得标准曲线回归方程A=13968.3C-13730.7，r=0.9990，结果表明血清中MHD在4.8～38.4 μg/mL线性关系良好。

2.3 方法回收率和精密度

分别精密量取96 μg/mL的MHD工作液适量，用甲醇稀释得到含MHD7.2、12、24 μg/mL低、中、高3种质控溶液，每个浓度平行配制5份，按“1.3.3”项下方法操作，进样分析，各浓度分别在同一日内测定，连续测定5 d。根据所得图形峰面积（A）代入相应的标准曲线中求得各样品浓度，以日内测得的实测浓度计算日内RSD，不同日测得的实测浓度计算日间RSD，以实测浓度与理论浓度的比值计算方法回收率。MHD的低、中、高3种浓度平均回收率均>95%，日内、日间RSD均<3%（n=5），见表1。

2.4 临床应用

应用建立的RP-HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD在体内的稳态谷浓度水平，测定时血中杂质无干扰。2016年1月～2017年12月共收集77例门诊及住院病例，其中在有效血药浓度范围内（《中国药典·临床用药须知·化学药和生物制品卷》（2010年版）推荐值为10～35 μg/mL[6]）的占46.75%（36/77），<10 μg/mL占53.25%（41/77），最低为1.11 μg/mL，>35 μg/mL占0。结果显示OXC在按常规剂量给药的情况下，存在部分患者血药浓度在有效浓度范围外，因此，需要在血药浓度监测下调整给药剂量，本方法能够满足临床血药浓度监测，也能用于患者过量服药情况下的中毒药物浓度监测，从而为患者制定个体化用药方案。

3 讨论

从奥卡西平的药动学特征来看，口服OXC后，其活性代谢产物MHD一般在2～3 d内达到稳态血药浓度。本文对癫痫患者口服OXC片后进行TDM，在给药前采集血样测定人血清中MHD稳态谷浓度水平。MHD在人血清中的血药浓度测定方法已有文献报道，通常采用LC-MS/MS法[7]和HPLC法[8-16]。LC-MS/MS专属性强、灵敏度高，但由于成本昂贵，不适用于常规检测。目前国内关于MHD药物浓度测定的HPLC法大多采用内标法进行测定[9-11，16]，操作较为繁琐，本文采用外标法进行测定，实验结果表明该方法简便快捷，也能准确地测定MHD的血药浓度。

MHD结构中有两个苯环，具有明显的紫外吸收。本实验在200～360 nm的波长范围内进行紫外扫描，发现检测波长为210 nm时，基线平稳，吸收值较大，灵敏度较高，因此选取210 nm作为检测波长。采用甲醇-水为流动相，按照不同配比进行检测，发现甲醇-水（35：65）时，血清中内源性杂质对样品测定无干扰，色谱峰最为理想。血样预处理方法包括固相萃取法[8]、液液萃取法[9-12]和蛋白沉淀法[13-16]。固相萃取法费用较高，操作繁琐；液液萃取法处理具有易乳化、易造成过程污染、提取不完全等缺点。本文采用有机溶剂蛋白沉淀法，操作简便、快速、成本较低，通过对文献报道的测定方法进行改进，采用甲醇[14-16]沉淀蛋白，采集血清量少，试剂价廉，毒性低，离心后直接取上清液进样，色谱分离好，方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，适用于临床血药浓度监测。

综上所述，抗癫痫治疗是一个长期的过程，我院目前開展奥卡西平的血药浓度监测，既是医生了解患者用药依从性的一种手段，同时也是医生监测患者治疗效果的一种方式，有助于医生针对个体癫痫患者调整用药方案，提高治疗效果，降低不良反应发生率。

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（收稿日期：2017-11-28）