不同植物生长调节剂对蓝果忍冬叶片愈伤组织诱导的影响

薛晓晓，秦 栋，霍俊伟，刘庆帅，刘化禹，谢佳璇，孙小娟，员盎然

（东北农业大学园艺园林学院，150030）

蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）为忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera）的一种新兴小浆果，俗称蓝靛果，我国大小兴安岭、长白山山区蕴含丰富的野生资源。其果实富含花色苷类、黄酮类以及多酚类等生物活性物质，氨基酸，糖类，有机酸，矿物质等营养物质，因此具有较高的营养和医疗保健价值，可以预防癌症，心血管，神经性，糖尿病等疾病[6]。

1 材料与方法

1.1 材料及培养

以2个引自俄罗斯的鲜食品种“邱雷姆”和“娜雷姆”为试材，MS培养基继代培养30d，取无菌苗中上部叶片，接种时在叶片正面横切几刀形成划痕，叶片背面接触培养基，接种到添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8，附加不同生长调节剂的MS培养基，于人工气候室暗培养相应时间后转移至光下培养，培养40天后调查结果。暗培养条件为湿度75%，温度25±1℃。

1.2 试验处理及方法

1.2.1 单一植物生长调节剂诱导叶片愈伤组织

以两品种的无菌苗叶片为材料，以MS为基本培养基，选用6-BA、2，4-D、TDZ、ZT和CPPU五种激素设计成单因素试验，浓度均为0.5、1.0、2.0mg/L。暗处理15天后置于光下培养。叶片在培养基培养40天后调查愈伤组织诱导情况。

1.2.2 两种植物生长调节剂组合诱导叶片愈伤组织

选用6-BA和2，4-D激素组合，TDZ和ZT激素组合，设计成两个复因素试验：暗处理15天后置于光下培养。叶片在培养基培养40天后调查愈伤组织诱导情况。

6-BA设两个水平：1.0、2.0mg/L，2，4-D设三个水平：0.2、0.5、1.0mg/L设计成6个水平组合的完全随机试验。

TDZ设两个水平：1.0、2.0mg/L，ZT设三个水平：0.1、0.3、1.0mg/L设计成6个水平组合的完全随机试验。

1.2.3 三种植物生长调节剂组合诱导叶片愈伤组织

在MS培养基中添加6-BA（0.5、1.0、1.5mg/L），IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）和KT（0.5、1.0、1.5mg/L），采用三因素三水平正交设计，按照L9（34）前三列安排试验，共9个处理组合（表1）。暗处理35天，统计出愈率，褐化率，观察愈伤组织状态。

表1 蓝果忍冬叶片愈伤组织诱导正交设计

1.3 数据统计与处理

出愈率（%）=愈伤组织数/外植体数×100，褐化率（%）=褐化叶片数/外植体数×100

所有试验均重复3次，数据统计分析及作图用SPSS19. 0 和 Excel软件。

2 结果与分析

2.1 添加两种植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

不同生长调节剂组合对蓝果忍冬叶片愈伤组织的诱导效果也不同。6-BA与2，4-D各个组合均能有效诱导叶片产生愈伤组织，但TDZ和ZT组合的诱导率极低，仅使邱雷姆出现少量愈伤且呈黄棕色，易褐化（见图1-J）。

6-BA与2，4-D组合的各处理诱导率均可达100%，且愈伤组织多呈绿色、黄绿色、深绿色或淡黄色，表面有瘤状突起，颗粒状，质地紧实，愈伤量多，愈伤组织生长快，无褐化（见图1A-F）。这与单独添加2，4-D诱导的愈伤组织有差异，可能是细胞分裂素与生长素相互作用的结果。各处理的愈伤量略有差异，当6-BA浓度为1.0mg/L时，邱雷姆叶片愈伤量随2，4-D浓度升高而增多，娜雷姆愈伤量则先增多后减少，在2，4-D浓度0.5mg/L时愈伤量达到最多，但少于邱雷姆。6-BA浓度为2.0mg/L时，两品种都是在2，4-D浓度0.5mg/L时达到最大愈伤量。各处理的娜雷姆愈伤量普遍少于邱雷姆，这可能是由品种差异所致。

表2 6-BA 与2，4-D组合对叶片愈伤组织诱导的影响

表3 TDZ与ZT组合对叶片愈伤组织诱导的影响

图1 两种生长调节剂组合诱导的愈伤组织

（A-F）6-BA+2，4-D诱导叶片愈伤组织；（A）愈伤启动；（B）光下转绿；（C-F）愈伤组织逐渐长大为深绿色致密型；（J、H）TDZ2.0mg/L+ZT1.0mg/L诱导的愈伤组织；（I）TDZ2.0mg/L+ZT0.3mg/L诱导的愈伤组织。

2.2 添加三种植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

三种调节剂6-BA、IBA、KT的9种组合处理对蓝果忍冬不同品种叶片愈伤组织的诱导效果不同（表4），方差分析表明，影响邱雷姆叶片愈伤组织诱导的主次因素为IBA＞6-BA＞KT，而影响娜雷姆叶片愈伤组织诱导的主次因素为KT＞IBA＞6-BA（表5，6）；两品种有所差异，这可能与不同品种对细胞分裂素的敏感性有关；MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+KT0.5mg/L（处理6）对两品种的诱导率均达到95%以上，可以作为通用的体系。

三种调节剂组合各处理诱导的愈伤组织形态基本相同，都为黄色颗粒状，质地较硬（图2）。结合表4和图2，不论是从诱导率还是愈伤量、褐化状况考虑，邱雷姆的诱导效果均好于娜雷姆，这可能与品种差异有关。

2.3 三种不同添加方式对蓝果忍冬叶片愈伤组织诱导的比较

通过图1、图2愈伤组织形态对比以及表2、表4的数据对比，不同方案的愈伤组织诱导效果不同。添加单一的生长调节剂，2，4-D是诱导蓝果忍冬叶片产生愈伤组织最有效的物质，浓度范围0.5-2.0mg/L均有效，6-BA、TDZ、ZT、CPPU效果不好。

添加两种调节剂处理好于单一调节剂处理，虽然2，4-D处理各浓度下出愈率都为100%，但愈伤组织质地多为淡黄色或绿色水渍状，较软，而2，4-D和6-BA配合处理下愈伤组织颜色多为绿色颗粒状，质地紧实致密，有利于后期培养和不定芽诱导，且愈伤量也多于2，4-D单独处理。

表4 6-BA、IBA、KT组合对叶片愈伤组织诱导的影响

表5 娜雷姆叶片愈伤诱导率结果方差分析

表6 邱雷姆叶片愈伤诱导率结果方差分析

图2 三种生长调节剂组合诱导的愈伤组织

6-BA、IBA、KT三种调节剂组合诱导率低于2，4-D和6-BA配合处理，且愈伤启动时间长，愈伤组织生长慢，该方案两个品种的诱导效果差异很大，娜雷姆诱导率低，最低为处理4的59%（表4）。愈伤量很少且褐化率高（图2-F），邱雷姆愈伤量很多（图1A-C），与单独添加2，4-D以及添加6-BA和2，4-D组合处理诱导的愈伤量相当，但质地更为紧实不易碎，相反6-BA和2，4-D组合处理则更加松脆（图2）。

3 讨论

蓝果忍冬是极具开发前途的小浆果，但目前品种及优良苗木缺乏。研究蓝果忍冬的组织培养不但能提高苗木扩繁速度，更能加快品种选育进程，具有很大的实践意义

在各种植物的愈伤组织诱导中，使用最多的是2，4-D。早熟禾种子单独添加2，4-D即可诱导产生愈伤组织，1.0mg/L～2.0mg/L诱导效果较好，0.1或0.2mg/L 2，4-D与3mg/L 6-BA组合的诱导效果明显好于2，4-D单独处理，本试验具有类似的结果，邱雷姆和娜雷姆分别在2，4-D浓度1.0和2.0mg/L时诱导效果最好，且6-BA与2，4-D组合处理好于2，4-D单独处理。

一般高浓度2，4-D不利于愈伤组织诱导分化，黑果枸杞愈伤组织诱导培养基为MS＋2，4-D2.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，愈伤组织分化培养基为 MS＋2，4-D1.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，即低浓度2，4-D利于分化，本研究娜雷姆在2，4-D浓度0.5mg/L时，愈伤组织更为致密，有利于愈伤组织的进一步分化。单独使用6-BA不能诱导杜仲叶片产生愈伤组织，6-BA与生长素NAA配合使用可诱导出较好的愈伤组织，本研究结果也表明单独添加6-BA的叶片愈伤组织诱导率为0，但与生长素2，4-D结合效果很好，表明细胞分裂素类和生长素类配合使用的愈伤组织诱导效果好于单独使用生长素类。

单独添加细胞分裂素6-BA、TDZ、CPPU均能诱导毛桃叶片产生愈伤组织，1.0mg/L CPPU也能有效诱导苎麻叶片产生愈伤组织并再生不定芽。1.0mg/L ZT可诱导矮丛蓝莓茎段直接器官再生，5.0mg/L ZT可诱导外植体通过愈伤组织途径再生。本研究结果表明CPPU、TDZ、ZT虽然具有高活性，但对蓝果忍冬叶片愈伤组织诱导效果不好，原因可能与物种不同有关。TDZ和ZT组合使蔓越橘茎段离体再生频率能达到60%。本研究表明该组合效果不好，不适用于蓝果忍冬的离体诱导及再生。

金铁锁上的研究表明在6-BA与生长素NAA组合的基础上添加KT，带芽茎段的出愈率和芽丛分化率均高达100%，本研究采用6-BA、2，4-D、KT组合处理时两品种的诱导率均在60%以上，且邱雷姆在大部分处理下的诱导率为100%，证明KT对蓝果忍冬愈伤组织诱导效果显著，值得在今后的试验中进一步研究。

利用叶片进行愈伤组织诱导具有取材广，效率高的特点，可提高苗木快繁效率，是离体再生体系的建立的基础；本试验只是对不同生长调节剂对叶片愈伤组织的诱导进行了初步研究，由愈伤组织到可在市场利用的完整植株还需经过愈伤组织分化不定芽以及生根培养，炼苗移栽等多项环节，因此蓝果忍冬的组培快繁体系的建立还需要进一步研究。