地稔总黄酮的纯化工艺研究

杨 菁，朱 丹，杜雨涵，谢 娟，蒋乐巧

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025)

地稔为野牡丹科植物地稔Melastoma dodecandrum Lour. 的干燥全草，又名土茄子、山辣茄、地脚稔、地枇杷等[1]。关于地稔的最早记载见于《岭南采药录》中，是畲族、瑶族、苗族等一些少数民族的常用药材[2]，主要分布在广西、广东、贵州、湖南、浙江、福建等地区[3]。地稔归心、肝、脾、肺经，性凉，味甘、涩，主要功效为活血止血、祛风利湿、消肿祛瘀、清热解毒。地稔全株供药用，其果实可以食用，还可以用来酿酒，临床主治发热、水肿、疼痛、痢疾、痈疮、黄疸、崩漏等病症[4]。地稔的药材资源丰富，使用范围广泛，临床疗效显著，具有广阔的开发利用前景。

地稔具有多种化学成分，其主要有效成分之一为黄酮类化合物。目前对地稔的研究主要集中在化学成分、药理作用、营养保健等方面，且对其中的黄酮类化合物仅有部分化学成分及药理作用的报道，其综合开发利用还处于空白阶段。因此，本文以地稔的总黄酮作为提取物，研究其纯化工艺，可为中药制剂、保健食品和化工产品的原料开发提供参考依据，也为该药材进入国际国内市场奠定坚实的基础。

1 试药与仪器

1.1 试药

药材产于贵州省龙里县羊场镇，经鉴定为地稔Melastoma dodecandrum Lour. 的干燥全草；聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)、D101型、AB-8 型、X-5 型、CAD-40 型、AP-20 型大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所)；芦丁对照品(贵州迪大生物科技有限责任公司，批号：GZDD-0001，>98%)；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，UV-5900型)；分析天平(奥豪斯仪器有限公司，EX2250ZH型)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA型)；数显恒温水浴锅(常州朗越仪器制造有限公司，SYG-2型)；电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司，101-1AB型)。

2 方法与结果

2.1 地稔总黄酮的含量测定[5]

称取于105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，加入60%乙醇溶解并定容，配制得浓度为0.5000 mg/mL的对照品溶液。

分别精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL对照品溶液，置于25 mL容量瓶中，依次加入6% NaNO2溶液0.6 mL、8% Al(NO3)3 溶液1.0 mL、2% NaOH溶液4.0 mL，加水定容显色15 min，于500 nm波长处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，计算得标准方程为A=11.614C+0.0266，相关系数R2=0.9998。表明芦丁对照品的浓度(C)在0.01～0.07 mg/mL范围内，与吸光度(A)呈良好的线性关系。

2.2 上样液的制备

称取地稔粉末5 g，置圆底烧瓶中，加60% 乙醇500mL，加热回流1 h，抽滤，回收乙醇，浓缩至体积为20 mL，即得总黄酮质量浓度约为9 mg/mL 的样品溶液。

2.3 树脂型号的确定

2.3.1 静态吸附试验

分别称取预处理好的各型号树脂10 g，置100 mL锥形瓶中，加入质量浓度为1.60 mg/mL的地稔总黄酮浓缩液50 mL，密塞，于室温条件下静置吸附24 h，过滤，测定滤液中的总黄酮质量浓度(mg/mL)，计算各型号树脂的吸附量(mg/g)及吸附率(%)，结果见表1。

2.3.2 静态解吸试验

分别将2.3.1试验中吸附饱和的各型号大孔吸附树脂加入95% 乙醇50 mL，密塞，于室温条件下静置解吸24 h，过滤，测定滤液中的总黄酮质量浓度(mg/mL)，计算各型号树脂的解吸率(%)，结果见表1。

表1 各型号树脂的吸附及解吸情况

由表1可知：各型号大孔吸附树脂对地稔总黄酮均有一定的吸附性，其中以D101型大孔吸附树脂的吸附量及吸附率最佳。此外，D101型大孔吸附树脂的解吸率也明显优于其他5 种型号。因此，选取D101型大孔吸附树脂作为研究地稔总黄酮纯化工艺的树脂。

2.4 地稔总黄酮的纯化工艺考察

2.4.1 上样液pH值的考察

以上样液的pH值为基准，分别用1 mol/L的HCl溶液或1 mol/L的NaOH溶液调节上样液pH值，使其分别为1.75、3.71(原液)、5.51、7.49、9.74。用不同pH值的溶液分别上样，收集经树脂吸附后的溶液，计算吸附率(%)，结果见图1。

图1 各pH值上样液对吸附率的影响

由图可知，随着上样液pH 值的增加，吸附率总体呈先增大后减小的趋势。当上样液的pH 值为3.71时，吸附率最大为57.31 %。而后随着上样液 pH值的增大，吸附率明显降低。因此，选取 3.71为最佳上样液 pH值，即用原溶液上样。

2.4.2 上样液质量浓度的考察

取6份质量浓度为9.15 mg/mL的上样液各20 mL，除第1份外，其余分别用蒸馏水稀释至40、60、80、100、120 mL。使6份上样液中总黄酮的质量浓度分别为9.15、4.58、3.05、2.29、1.83、1.53 mg/mL，分别上样，收集吸附后的溶液，计算吸附率(%)，结果见图2。

由图2可知，随着上样液质量浓度的增加，吸附率总体呈先增大后减小的趋势。当上样液质量浓度为3.05 mg/mL时，吸附率最大为75.89%，而后吸附率大幅降低。因此，选取3.05 mg/mL为最佳上样液质量浓度。

图2 各浓度上样液对吸附率的影响

2.4.3 树脂床径高比

取预处理好的D101型大孔吸附树脂，装柱，使径高比分别为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，备用。分别取5份已确定最佳质量浓度的上样液上样，收集吸附后的溶液，计算吸附率(%)，结果见图3。

图3 各树脂床径高比对吸附率的影响

由图3可知，随着树脂床径高比的增大，吸附率总体呈先增大后减小的趋势。当树脂床径高比为1∶6时，吸附率最大为75.79%。因此，选取1∶6为树脂床径高比。

2.4.4 上样液体积的考察

取预处理好的D101型大孔吸附树脂，按最佳树脂床径高比装柱，备用。取上样液上样，收集吸附后的溶液，每10 mL接取1管。测定每管收集液中的总黄酮质量浓度(mg/mL)，绘制上样吸附泄露曲线，结果见图2。

图4 大孔吸附树脂上样吸附泄漏曲线

由图4可知，最初由于大孔吸附树脂吸附不完全，吸附后溶液中的总黄酮质量浓度偏高；随后当上样量处于60～120 mL范围内时，吸附后溶液中的总黄酮质量浓度趋于稳定。当上样量超过120 mL时，流出液中的总黄酮质量浓度开始上升，此时D101型大孔吸附树脂对总黄酮的吸附能力已达最大值。而后大孔吸附树脂吸附能力下降，上样液中的总黄酮开始泄漏。为保证树脂吸附能力及纯化效果，故选取120 mL为最佳上样量。

2.4.5 洗脱剂体积分数的考察

分别取5份上样液各120 mL上样，待其吸附完全，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色，再分别用体积分数为30%、45%、60%、75%、95% 的乙醇各100 mL洗脱，收集解吸后溶液，计算解吸率(%)。再分别取各溶液10 mL于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105 ℃烘箱中干燥3 h，测定浸膏重量(g)，计算总黄酮的纯度(%)，结果如下。

表2 各体积分数洗脱剂的解吸率及总黄酮纯度

由表2可知，随着洗脱剂体积分数的增加，解吸率及解吸后溶液中的总黄酮纯度逐渐增大。洗脱剂体积分数过小时，只有少部分总黄酮被解吸出来，且解吸后溶液中的总黄酮纯度较低。当洗脱剂体积分数为95%时，解吸率及解吸后溶液中的总黄酮纯度最大。因此，选取95% 为最佳洗脱剂体积分数。

2.4.6 洗脱剂体积的考察

取上样液120 mL，上样，待其吸附完全，用蒸馏水洗脱至流出液呈无色，再用体积分数为95% 的乙醇洗脱，收集解吸后溶液，每10 mL接取1管。测定每管溶液中的总黄酮质量浓度(mg/mL)，绘制洗脱曲线，考察洗脱剂体积，结果见图5。

图5 不同洗脱剂体积的考察

由图5可知，不同体积洗脱剂的洗脱曲线峰型集中，在第2管，即加入20 mL洗脱剂后，洗脱出的总黄酮的量达到最高值；在加入100 mL洗脱剂后，总黄酮基本洗脱完全。因此，选取100 mL为洗脱剂的体积。

2.5 最佳纯化工艺验证

按照优选的地稔总黄酮最佳纯化工艺，对该工艺进行验证试验，试验结果见表3。

表3 最佳纯化工艺验证

由表3可知，在最佳工艺条件下，纯化得到地稔总黄酮平均纯度达50% 以上，且该工艺稳定。

3 讨论

在研究地稔总黄酮的纯化工艺之前，课题组运用单因素试验法和正交试验法，优选出了地稔中总黄酮成分的最佳提取工艺，并初步建立了稳定可靠的含量测定方法，为地稔总黄酮的大孔吸附树脂纯化工艺研究奠定基础。