摄食全豆粕蛋白饲料的牛蛙肠道微生物组成

王 健，王 玲，鲁康乐，宋 凯，张春晓

(厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

肠道是动物机体与外界环境接触最为密切的器官之一，也是最大的免疫器官，在肠道中共生着大量微生物。大部分肠道微生物与动物构成共生关系，相互依赖，在动物的生长、营养、免疫等方面均发挥着重要的作用[1-2]。研究表明，仔猪小肠中的微生物能大量代谢必需氨基酸，参与氨基酸的肠道首过代谢，并且对氨基酸表现出较强的合成能力[3]；牛的瘤胃中的微生物可以帮助其消化植物纤维，摄取所需能量，还具有分解有毒物质的能力[4-5]；大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肠道中微生物与碳水化合物、氨基酸、蛋白质、核酸代谢功能相关[6]。因此，研究动物生理，尤其是营养代谢，必须考虑肠道微生物作用。

在过去对肠道微生物组成的研究中，传统方法如DGGE、TGGE、T-RFLP、FISH等，往往会很大程度地低估肠道微生物的物种组成并高估其丰度[7]。高通量测序技术具有较高准确性和灵敏度的优势，不需要进行肠道微生物的分离和培养，只要提取到肠道微生物DNA后，就能得到相应菌种信息，能够较为完整地反映肠道微生物结构。王程程等[8-9]的研究表明，高通量测序技术相比传统方法更具优势，鉴定所得肠道微生物组成信息更为完整。目前，高通量测序技术已经在黄颡鱼(Pseudobagrusfulvidraco)[10]、大菱鲆[11]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[12-13]等多种水生动物肠道微生物研究中运用，是目前对动物肠道微生物研究中应用最广泛的方法之一。

牛蛙(Rana(Lithobates)catesbeiana)是我国福建、广东、浙江和海南等地重要的养殖种类之一，2013年国内牛蛙养殖产量已达15万t以上[14]。研究表明，大多数动物缺乏内源性纤维素消化酶基因，纤维素的消化主要依靠肠道内与纤维素降解相关的菌群[15-16]，因此肠道微生物组成很大程度上决定了动物利用植物原料能力的高低。已有研究发现牛蛙对豆粕耐受能力较强[17]，并且对植物性蛋白原料有较高的表观消化率[18]。根据以往研究结果推测，摄食植物性蛋白原料的牛蛙肠道中应存在较高比例与植物性原料消化相关的菌群，然而，目前尚未有对牛蛙肠道微生物组成的相关报道。本文将运用高通量测序技术，研究摄食全豆粕蛋白饲料的牛蛙肠粘膜及肠腔内容物的微生物组成，拟从肠道微生物组成来解释牛蛙对豆粕有较高利用率的原因，并为深入研究牛蛙营养代谢机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验用饲料以豆粕为主要蛋白源，鱼油、豆油和卵磷脂为主要脂肪源，粗蛋白质量分数为40%、脂肪质量分数为7%。饲料原料粉碎后全部通过60目筛网，用水产饲料膨化机制成4.0 mm的膨化颗粒饲料，自然晾干后于-20 ℃冰箱中保存。试验饲料配方和化学组成见表1。

1.2 试验牛蛙的养殖管理

养殖蛙苗为厦门市同安区一养殖场提供的同批次孵化蛙苗。正式试验开始前，牛蛙暂养于室内水族缸(1.5 m×0.7 m×0.6 m)中，投喂商业牛蛙饲料(由福建省海新集团有限公司提供)。暂养15 d 后，停食24 h，挑选个体大小均匀，体表无损伤的健康牛蛙随机分配到室内6个水族缸(0.7 m×0.4 m×0.4 m)中，除排列位置外，各缸管理、光照、用水均保持一致。试验牛蛙初始体重为(40.01±0.24)g，每个养殖缸放养14只牛蛙，每天投喂2次(8：00，18：00)，达表观饱食状态。养殖试验持续56 d。试验期间水温30～32 ℃，投喂前半小时对各缸进行清洗和换水，水位为3～5 cm。

表1 试验饲料配方及营养组成(干物质)

说明： 1)参考文献[19]；2)，3)参考文献[18]。

Notes:refer to referenc [19]；2)，3) refer to reference[18].

1.3 肠道样品采集

56 d试验结束时停食24 h后，选择健康状况良好、大小相似的牛蛙(平均体重为(133.56±0.14)g)，每缸6只，用双毁髓法处死，剪下牛蛙肠道并用镊子按压收集牛蛙肠腔内容物置于灭菌冻存管中；收集完成后剪开肠段，用无菌生理盐水冲洗肠粘膜，取另一冻存管存放肠粘膜样品；每2个养殖缸样品混合视为同一样品。样品采集完成后迅速放入液氮中保存，用于微生物多样性分析。

1.4 细菌V3+V4区微生物多样性测序

提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化后形成测序文库，对建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行微生物多样性测序。

1.5 计算和统计方法

使用QIIME(Version 1.8.0)软件中的UCLUST对Tag在97%的相似度水平下进行OTU(operational taxonomic units)聚类分析；利用QIIME软件生成不同分类水平下的物种丰度表；使用Mothur(Version 1.30)软件，对样品Alpha多样性指数(Chao1、Ace、Shannon、Simpson)进行评估；使用SPSS 18.0软件对数据进行方差分析，实验结果采用(平均值±标准误差)表示；基于unweighted unifrac算法得到样本间距矩阵用于主成分分析(PCA)；基于non-parametric factorial Kruskal-Wallis(KW) sum-rank test(非参数因子克鲁斯卡尔—沃利斯秩和验检)检测具有显著丰度差异特征，用线性判别分析(LDA)来估算差异大小。本文所有图均根据数据用R语言工具绘制。

2 结果

2.1 数据过滤、拼接及稀释曲线

对牛蛙肠腔内容物样品(DN)和肠粘膜样品(DC)中细菌的16S rDNA基因的V3-V4区测序，所有样品经过双端reads(PE read)拼接后得到517 972条原始序列(Raw Tags)，经过原始序列过滤后得到的优化序列(Clean read)共有487 821条，平均每个样品产生81 303条序列，最多的产生108 448条，最少的65 443条，样品平均序列长度(AvgLen)为436.17 bp，优化序列数平均占原始双端reads总数的63.035%，表明本次提取样品的DNA质量良好。

稀释性曲线(见图1)显示，当抽取序列数达到50 000条时，每组样品的稀释曲线都趋于平坦，说明测序数据量足够大，更多的数据量对发现新OTU的贡献很小，表明此次测序样本抽取序列充分，结果可靠。

2.2 牛蛙肠粘膜及肠腔内容物微生物OTU划分及Alpha多样性比较

表2为将样品序列按最小序列数进行标准化后，在97%相似度水平下，比较Alpha多样性指数。结果显示，在0.99的样本文库覆盖率下，样品间 OTU数量、丰度指数Ace及Chao1，DN组均大于DC组，但未具显著性(P>0.05)；多样性Shannon指数差异不显著(P>0.05)； Simpson指数DN组显著低于DC组(P<0.05)。

表2 不同样品微生物群落的丰度和多样性指数

说明：同一列数据的肩标不同字母，则表示显著性差异(P<0.05)。

Note：In the same column values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05) .

2.3 门、属分类水平上牛蛙肠粘膜及肠腔内容物微生物组成

物种分布柱状图显示，在门分类水平(见图2)上， DC组中梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)为牛蛙肠粘膜的优势菌，分别占总菌群数量的78%和20%，厚壁菌门(Firmicutes)约占1%； DN组中，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)为牛蛙肠道内容物中的优势菌，分别占总菌群的76%、15%和5%，放线菌门(Actinobacteria)约占1%。在属分类水平(见图3)上，DC组中菌群组成表现出高度相似性，其中梭杆菌门(Fusobacteria)的鲸杆菌属(Cetobacterium)、变形菌门(Proteobacteria)的埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)和爱德华氏菌属(Edwardsiella)为主要优势菌群，分别占总菌群比例的75%、3%和2%左右；DN组菌群组成在属分类水平上未显示出明显规律。

2.4 牛蛙肠粘膜及肠腔内容物微生物样品PCA分析

样品微生物PCA分析(见图4)显示，PC1成分贡献率为70.57%，PC2成分贡献率为19.00%，2种成分的累计贡献率已达89.57%，能反映样本的大部分信息，表明通过PCA分析可以较好区分样品。其中肠粘膜样品DC主要分布在二、三象限交界处，且3组样品相对聚集；肠道内容物DN的3组样品分散在一、四象限中，且彼此间间距较大。表明经过56 d饲养后，牛蛙肠粘膜上微生物组成基本稳定，且与肠腔内容物微生物组成存在明显差异。

2.5 组间样品LDA值分布

组间样品的LDA值分布见图5。进化分支图由内至外辐射的圆圈代表了由门至种的分类级别，在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比，而着色原则为将无显著差异的物种统一着色为黄色，其他差异物种按该物种所在丰度最高的分组进行着色。结果显示，DC组与DN组微生物相对丰度存在显著差异(LDA值>4)的菌群，分属于三个门类，分别为变形菌门的γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)和α变形菌纲(Alphaproteobacteria)，梭杆菌门的梭杆菌纲(Fusobacteriia)和厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌纲(Bacilli)。其中，在属水平上，DC组中鲸杆菌属(Cetobacterium)、埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)和爱德华氏菌属(Edwardsiella)相对丰度高于DN组；DN组中的不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomnas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)相对丰度高于DC组。

3 讨论

动物肠道微生物是一个复杂的微生态系统。随着对肠道微生物功能研究的逐渐深入，许多研究表明肠道微生物能够参与并影响宿主营养代谢和免疫调节[3，5，20]，因此在动物生理研究，尤其是营养代谢的研究中，必须充分考虑肠道微生物的作用。以往的研究结果表明，水生动物的饲料组分是影响其肠道微生物组成的重要因素之一[21]，如摄食豆粕饲料的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，其肠道中存在高比例的厚壁菌和变形菌[22]；摄食豆粕饲料的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲫鱼(Carassiusauratus)，肠道中存在高比例的厚壁菌和变形菌，并且鲫鱼肠道还存在高比例的梭杆菌[23]；摄食豆粕饲料的金头鲷(Sparusaurata)，其肠道存在高比例的厚壁菌、放线菌[24]。本次试验结果显示，摄食全豆粕蛋白的牛蛙，其肠道主要优势菌群为梭杆菌、变形菌以及厚壁菌，这与以往对摄食豆粕蛋白的鱼类肠道微生物研究结果是一致的，并且与王纯等[25]对草食性的草鱼及团头鲂(Megalobramaamblycephala)肠道微生物研究结果相似，均以变形菌门及厚壁菌门细菌为肠道优势菌种，相似的结果也在赵晗旭[26]对陆地草食性动物的研究中有报道，暗示此门类细菌在肠道中的优势存在可能与摄食植物性蛋白源有关。

以往的研究[23]表明，水产动物肠腔内容物与肠粘膜中的微生物组成存在一定的相似性，并且都受外源环境(水、饲料等)微生物的影响，但同时宿主本身对肠粘膜定植菌种有一定的选择作用[23]。本次试验中，微生物组成结构图显示，牛蛙肠腔内容物中优势菌种门类为变形菌门(76%)、厚壁菌门(15%)和梭杆菌门(5%)；牛蛙肠粘膜样品中优势菌种门类为梭杆菌门(78%)和变形菌门(20%)；LDA值分布显示，牛蛙肠腔内容物中变形菌门的菌丰度显著高于肠粘膜组，表明摄食全豆粕蛋白饲料的牛蛙肠腔内容物中优势菌为变形菌，且多数不能在牛蛙肠粘膜上定植。王程程等[9]研究表明变形菌门类细菌是饲料和养殖水体中最优势菌种，而牛蛙肠腔内容物主要由未被完全消化的食物残渣组成，牛蛙的进食行为会将饲料及水体中携带的微生物带入到肠腔中，这可能是在牛蛙肠腔内容物中检测出大量变形菌的主要原因，而摄食等行为带来的外源微生物只有小部分能在肠粘膜上定植[27]，导致肠腔内容物中最优势存在的变形菌在肠粘膜上不显最优势性，这与以往的研究结果是一致的。

本次试验结果显示：牛蛙肠粘膜上最优势菌门为梭杆菌门，且其丰度显著高于肠腔内容物中的该菌，表明该门类菌受外源环境影响较小，可以在肠粘膜上定植；在属分类水平，梭杆菌门下鲸杆菌属是最优势菌种。以往研究表明，在人类、大熊猫、牛以及硬骨鱼[15-16]体内缺乏内源性纤维素消化酶基因，因此其对纤维素的消化主要依靠肠道内与纤维素降解相关的菌群；Parma等[24]研究发现，当金头鲷饲料中植物纤维成分增加时，其肠道中具消化纤维素能力的菌群会增多；Wu等[28]研究发现，草鱼肠道中优势菌群为梭杆菌门细菌，其具有降解植物纤维、促进碳水化合物的发酵和能量转换的功能，可提高植物成分消化率；文献[16，29]研究表明，梭杆菌门下鲸杆菌属细菌在淡水草食性、杂食性和滤食性鱼类肠道中为常见优势菌，具有发酵多肽、碳水化合物的能力，还可以产生维生素B12，被认为是一种具益生作用的菌种。本次试验结果还显示，当牛蛙摄食富含植物纤维成分的豆粕饲料时，其肠粘膜上会定植大量梭杆菌门及其门下鲸杆菌属细菌，这些菌种与碳水化合物及纤维素消化相关，可以帮助宿主消化并利用植物性蛋白，这可能是Zhang等[18]发现牛蛙对饲料中植物性原料有较高利用率的原因之一。

PCA分析结果显示，经过56 d养殖试验后，肠粘膜样品间的微生物组成相似度较高，而肠道内容物样品的微生物组成相似度较低。这表明：当牛蛙适应养殖条件和环境时，其肠腔内容物微生物组成容易受到外源微生物影响，个体间差异也较大，而肠粘膜微生物菌群结构达到动态平衡后更为稳定，受个体差异影响较小，更适合用于研究饲料对牛蛙肠道微生物组成的影响。

埃希氏菌-志贺氏菌属和爱德华氏菌属是水产动物常见致病菌，能够导致水产动物腹泻、腹水及败血症等疾病[30-32]。以往研究认为，豆粕中的抗营养因子能够破坏肠道组织结构，影响营养成分吸收利用，是引起水产动物肠道炎症的主要原因之一[33-34]。本实验结果显示，饲喂牛蛙全豆粕蛋白饲料，其肠道粘膜上会定植一定比例的埃希氏菌-志贺氏菌属和爱德华氏菌属细菌，这两类菌均为条件致病菌，在特定条件下，会引发宿主肠道疾病，这或许是植物蛋白替代鱼粉后，动物肠道炎症发生的原因之一。

本次实验中，牛蛙肠道内容物的微生物丰度指数和多样性指数均大于肠粘膜，但不显统计学差异(P>0.05)，其原因可能是本次试验中将多个采集样品混作一个样品进行检测，造成最终统计样本不足，因此统计学差异不显著，应在今后研究中避免此类问题。本次试验显示，摄食全豆粕蛋白饲料的牛蛙肠粘膜上会定植与碳水化合物及纤维素消化相关的梭杆菌门和鲸杆菌属细菌，后续将对牛蛙饲料中豆粕的添加比例对肠粘膜上该门类细菌数量的影响进行研究，从而进一步揭示肠道微生物对牛蛙营养代谢的影响。

4 结论

本次试验结果表明摄食全豆粕蛋白饲料的牛蛙肠粘膜上会定植大量与碳水化合物及纤维素消化相关的梭杆菌门及其门下鲸杆菌属细菌，这可能是牛蛙对植物性原料有较高利用率的原因，但同时高水平豆粕也存在引起牛蛙肠道疾病的潜在风险。