动脉粥样硬化病人血同型半胱氨酸与Smad7甲基化关系的研究

韦丽华

【摘要】目的：探讨动脉粥样硬化病人血同型半胱氨酸水平与Smad7基因甲基化的关系。方法：选取我校附院经颈动脉彩超确诊的45名动脉粥样硬化患者及26名健康对照，采集血液样本进行同型半胱氨酸浓度测定及用Sequenom甲基化检测法检测Smad7基因甲基化水平。结果：与健康对照组相比，动脉粥样硬化病人的血清同型半胱氨酸濃度明显升高，同时，Smad7基因甲基化程度亦明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）。结论：同型半胱氨酸可能通过诱导Smad7基因启动子的高甲基化促进动脉粥样硬化的发生发展。Smad7基因甲基化为防治动脉粥样硬化提供新的作用靶点。

【关键词】动脉粥样硬化；同型半胱氨酸；Smad7；Sequenom甲基化检测法

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是严重威害人体健康的常见病。AS的发病受许多危险因素影响，大量的流行病学资料表明，血同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平的升高是其中的一个重要的独立危险因素。Hcy可通过炎症反应、细胞外基质重构、干扰甲基化反应等促进AS的发生发展[1]。据研究报道，Smad7可以抑制炎症纤维化反应，但其在AS中的作用鲜见报道。由于Smad7基因启动子区可受甲基化调控[2]，本研究探讨AS病人血中Hcy水平与Smad7基因甲基化的关系，为AS的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象及标本采集

由固定专人采用彩色超声血流仪行两侧颈动脉检查以确定研究对象。分别检查双侧颈内动脉起始处、颈动脉分叉部、颈总动脉。检查内容包括：颈动脉内膜中层厚度（IMT）及有无斑块形成。内膜中层厚度<1.0mm为内膜中层厚度正常，以内膜局限性突出管腔，内膜厚度≥1.1mm为斑块形成指标。疾病组病人来自2015年9月至2016年10月广西科技大学第一附属医院心胸血管内科经颈动脉彩超证实有AS病变的45名患者（男33例，女12例，平均68.2岁），这些患者排除了肿瘤、结缔组织病及内分泌代谢紊乱症；对照组为经该院体检科检查体检报告正常，且经颈动脉彩超检查无IMT增厚及无AS斑块形成的26名健康人（男19例，女7例，平均67.2岁）。疾病组和对照组在年龄、性别构成上相当。抽取AS病人和健康对照者清晨空腹肘静脉血，全血-80℃冰箱保存备用于提取基因组DNA，血清用于Hcy浓度测定。

1.2 Hcy浓度测定

按照Hcy检测试剂盒（迈克，中国）说明书，用循环酶法检测AS病人和健康对照者血清Hcy浓度。

1.3 基因组DNA提取与亚硫酸氢盐修饰

按照试剂盒（天根，中国）说明书，从AS病人和健康对照者外周血提取基因组DNA。紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度并通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按照试剂盒（QIAGEN，瑞士）说明书，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。

1.4 Sequenom甲基化检测

用EpiDesigner软件进行引物设计。设计的引物覆盖富含CpG位点的Smad7基因启动子区。如图1所示，扩增区位于转录起始点附近，从-619到-196。正向引物序列为5-aggaagagagTGGTAGAAGAAAAGGAGAGGAAGAT-3'，反向引物序列为5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAACCTCTTTCCCCCTTACTAAAC-3。经亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA进行PCR扩增反应，条件如下：变性94℃ 4分钟，（94℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒）循环45次，最后72℃延长3分钟。之后进行SAP酶消化处理和酶切反应，树脂纯化后上机检测。

1.5 统计分析

实验数据以均值士标准误表示，两组间比较采用SPSS16.0统计软件进行t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy测定结果

与健康对照者相比，AS病人的血清Hcy浓度明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）（图2）。

2.2 Sequenom甲基化检测结果

选取Smad7基因启动子区第5，8，15，16CpG位点的CpG比值的平均值来进行比较。结果显示，与健康对照者相比，AS病人的甲基化程度明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）（图3）。

3 讨论

AS的致病机制包括细胞外基质堆积、炎症反应及DNA甲基化紊乱。Hcy，一种含硫氨基酸，是体内甲硫氨酸循环的正常代谢产物，是能量代谢及许多需甲基化反应的重要的中间产物。正常状态下，血浆Hcy浓度为5～15μmol/L，超出此范围即为高Hcy血症。DNA甲基化是表观遗传修饰的一种。随着近年来对表观遗传学的深入研究，Hcy对心血管疾病发病的表观遗传学调控受到越来越多的关注。DNA的甲基化在Hcy致AS发病中发挥了重要的作用。在AS病损部位，呈现整个基因组低甲基化和部分特异基因启动子区CpG岛的高甲基化。基因高甲基化，低表达。Smad7可以抑制炎症纤维化反应，在许多疾病中发挥重要作用[3，4]，但其在AS中的作用鲜见报道。近期研究报道，Smad7基因启动子区可受甲基化调控，在大鼠的肝纤维化病变中，Smad7高甲基化低表达[2]。本研究分析的Smad7启动子区包含一个CpG岛（16个CpG位点），覆盖TATA-box和GC-box，与基因转录密切相连。所采用的Sequenom甲基化检测法能够特异性地定量分析多个CpG位点甲基化水平，准确高效。由结果得知，随着AS病人血清Hcy浓度的升高，其Smad7基因启动子区甲基化水平也明显升高。因为高甲基化影响基因的转录，据此推测Smad7低表达从而促进AS的炎症纤维化病变。

综上所述，Hcy可能通过诱导Smad7基因启动子的高甲基化促进AS的发生发展。检测Smad7启动子甲基化水平可辅助临床上对AS的诊断，而Smad7基因的甲基化也为防治AS提供新的作用靶点。

参考文献

[1]Dionisio N，Jardí n I，Salido GM，etal.，Homocysteine，intracellularsignaling and thromboticdisorders，Curr MedChem.17（2010）3109-3119.

[2]E.B.Bian，C.Huang，H.Wang，etal.，Repression of Smad7 mediatedby DNMTldetermines hepaticstellate cell activation andliver fibrosis in rats，ToxicolLett，224（2014）175-185.

[3]Liu Z，HuangXR，ChenHY，etal.，Deletion of Angiotensin-ConvertingEnzyme-2 PromotesHypertensiveNephropathy by Targeting Smad7for Ubiquitin Degradation，Hypertension.70（2017）：822-830.

[4]BianL，HanG，ZhaoCW，etal.，The roleof Smad7 in oral mucositis，ProteinCell.2015：160-169.