嗜肺军团菌感染对巨噬细胞RAW264.7细胞因子表达的影响

于纪棉 张玉琳 曾斌 黄素文 赵秀玲 王建峰 刘玉新

嗜肺军团菌是一种兼性细胞内寄生的人畜共患病病原体，广泛存在于天然淡水和人工水域等多种水体环境中。近些年我国几大城市集中空调冷却塔嗜肺军团菌污染调查结果显示嗜肺军团菌污染严重：上海51.60%，江苏镇江15.00%～46.67%、深圳46.20%[1-3]。嗜肺军团菌感染人类的主要途径为中央空调冷却塔工作时形成的含菌气溶胶，被免疫力低下的人群吸入，导致患者全肺发生炎症反应及肺部实质性病变，从而导致致命的急性呼吸道感染，在我国已有小规模暴发及散发病例报道。由于军团菌性肺炎与其他肺炎不易区别，病死率可高达15%～20%[4-6]。当前城市化进程加快，大型建筑增多，城市人口居住密度增高，军团菌病爆发和流行的可能性亦增高。嗜肺军团菌可被巨噬细胞吞噬，但却不能被其消灭，反而会在巨噬细胞内复制、繁殖。嗜肺军团菌逃逸巨噬细胞的杀伤作用也是其具有极大致病性的主要原因。本研究通过构建嗜肺军团菌体外感染巨噬细胞模型，检测巨噬细胞感染后分泌细胞因子的变化，探索嗜肺军团菌在巨噬细胞胞内生存的分子机制，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；嗜肺军团菌ATCC33152购自上海复祥生物科技有限公司；BCYEα培养基购自北京陆桥生物技术有限公司；DMEM高糖培养液购自美国GE公司；胎牛血清购自德国PAN公司；RNeasy Plant Mini Kit购自德国QIAGEN公司；EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物科技有限公司；Roche-LightCycler480Ⅱ荧光PCR仪购自美国罗氏公司；DMi8倒置显微镜购自德国莱卡公司。

1.2 方法

1.2.1 培养巨噬细胞RAW264.7 采用10%FBS的DMEM高糖细胞培养液，置于含5%CO2的37℃的细胞培养箱中培养，每2～3d传代1次。使用时采用0.1%的胰酶消化使其悬浮，计数并调整其浓度为1×106个/ml，铺于6孔板中继续培养。

1.2.2 嗜肺军团菌培养及菌悬液制备 嗜肺军团菌接种BCYEα培养基，培养5d，分别挑取生长状况良好的菌落，于BCYEα液体培养基中，37℃ 220 r/min培养过夜后取等量菌体转接至250 ml BCYEα液体培养基中，37℃220 r/min继续培养。对数生长期测定菌体的密度，用DMEM培养液（含10%FBS）稀释成菌悬液，调整细菌浓度。

1.2.3 嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7 嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7参照熊丽娜等[7]方法，巨噬细胞RAW264.7以1×106/孔，铺6孔板，根据 OD600值调节细菌浓度，按感染复数（MOI）为10感染巨噬细胞RAW264.7。培养体系为室温800g离心10 min，37℃5%CO2条件下培养1h，移除含菌液的培养基，加入含硫酸庆大霉素200 mg/L的新鲜DMEM培养基，相同条件下，处理1h以杀死细胞外的军团菌。移除培养基，PBS轻轻吹洗5次，加入含5%FBS的DMEM培养基。分别于感染前、感染后6、12、24h用镊子取片，PBS冲洗5次，倒扣于洁净的载玻片上，在倒置显微镜下观察嗜肺军团菌在细胞内的生长和增殖情况。

1.2.4 荧光定量PCR检测 分别在感染前、感染后6、12、24、36h取材，用于细胞因子的检测。按照RNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书提取细胞总RNA，将细胞总RNA按照EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒逆转录获取cDNA，然后进行PCR。PCR反应条件：95℃，5min；40 个循环：95℃，15s；58℃，30s（收集荧光）；熔点曲线分析55～95℃。PCR反应体系为：TransStart Green qPCR SuperMix 10μl，上游和下游引物各0.5μl（表1），cDNA模板2μl，双蒸水补至20μl。测定IL-6、TNF-α、Caspase-1和 Bcl-2 4个基因，均由深圳华大基因公司合成，试验所得数据采用2-ΔΔCt进行相对定量结果分析。

表1 各目的基因引物序列

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，不同时间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 嗜肺军团菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖情况 见图1。

图1 嗜肺军团菌在巨噬细胞RAW264.7内的增殖情况（a：0h；b：6h；c：12h；d：24h）

由图1可见，显微镜下，正常贴壁的巨噬细胞RAW264.7呈圆形，形态完整。嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7后，其感染周期可大致分为3个阶段，感染早期（0～12h）：嗜肺军团菌被巨噬细胞RAW264.7吞噬后，会形成一个吞噬泡（图1b箭头所示），细菌形成明显的复制囊泡并在其中生长繁殖。快速增殖期（12～24h）：细菌形成明显的复制囊泡并在其中生长繁殖，并与周围囊泡逐渐融合形成一个或少数几个大囊泡（图1c箭头所示）。传播期（24h后）：巨噬细胞RAW264.7膜出现崩解（图1d箭头所示），有规则外形的菌团也随之破裂，释放出细菌，细菌缓慢地运动，逐渐扩散开去，至此嗜肺军团菌完成了一个感染周期。

2.2 嗜肺军团菌对巨噬细胞RAW264.7的细胞因子的影响 见图2。

图2 嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7后IL-6、TNF-α、Caspase-1、Bcl-2 mRNA相对表达量（与感染前比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图2可见，嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7后，IL-6 mRNA的表达量变化非常显著，感染6h后IL-6 mRNA的表达量（14.95）显著上升，与感染前比较，差异有统计学意义（t=8.14，P＜0.01），之后 IL-6 mRNA 逐渐下降，但仍高于感染前，与感染前比较，差异有统计学意义（t=7.9、8.6、7.5，均P＜0.05）。TNF-α mRNA 表达量在感染 6、12、24 和 36h 后分别为 4.78、3.15、3.98、2.44，虽然其变化趋势有所波动，但与感染前比较仍显著升高，差异有统计学意义（t=12.8、3.9、4.2、5.8，均P＜0.05）。Caspase-1 mRNA表达量在感染6h和12h时分别为2.13、2.04，与感染前比较，差异有统计学意义（t=7.3、9.5，均P＜0.05），感染 24h 和 36h 与感染前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Bcl-2 mRNA表达量在感染6、12和24h分别为4.10、3.99、2.48，与感染前比较，差异有统计学意义（t=7.3、6.6、4.3，均P＜0.05），感染36h后与感染前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

嗜肺军团菌是一种细胞内寄生菌，能感染并在人单核细胞、肺泡巨噬细胞、表皮细胞和巨噬细胞样细胞系中复制存活[8]。本研究是以巨噬细胞RAW264.7为宿主细胞模型，研究感染嗜肺军团菌后细胞因子的变化。

IL-6和TNF-α是导致机体炎症反应中关键的细胞因子，能够诱导细菌感染后的保护性免疫反应，因此在宿主免疫中起到很重要的作用。TNF-α一般认为可由巨噬细胞内源性分泌，参与细胞的增殖和分化、肿瘤的形成、细胞的凋亡、坏死等[9]。本试验结果显示，巨噬细胞RAW264.7感染嗜肺军团菌6h后，IL-6和TNF-α表达量显著上升，之后随着感染时间的延长虽有所下降，但其表达量仍高于正常。佳莉娟等[10]在研究重组嗜肺军团菌鞭毛蛋白A（rflaA）感染小鼠巨噬细胞RAW264.7时也发现IL-6的表达水平显著升高，与本试验结果相符。在新近的报道中证明IL-6可以抑制由结核分枝杆菌感染引起的巨噬细胞自噬，IL-6的分泌量增加有利于结核分枝杆菌抑制机体先天性免疫应答[11]。因此嗜肺军团菌能够刺激巨噬细胞发生强烈免疫反应，大量分泌IL-6和TNF-α。IL-6帮助巨噬细胞降低自噬，激活信号转导和转录激活因子的磷酸化，从而诱导抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-XL的表达[12-13]，有利于嗜肺军团菌长期存活。

Bcl-2是一种重要的凋亡抑制蛋白，具有保护细胞的功能作用。Ge等[14]研究也表明嗜肺军团菌的效应蛋白LegK1可以激活宿主的NF-κB信号转导通路，上调Bcl-2，使宿主细胞在感染后不会立刻启动具有保护作用的凋亡程序，利于嗜肺军团菌在宿主细胞内的生存；另外，效应蛋白SidF可直接与Bcl-2蛋白家族的成员相互作用，在感染过程中阻止宿主细胞凋亡。本试验结果显示，感染6h后Bcl-2表达量显著上升，其后表达量逐渐降低，但仍高于对照组，说明嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7 6h后，可能是通过抑制巨噬细胞RAW264.7的凋亡来完成自己在胞内的增殖，本试验形态学观察结果也显示嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7 6h后出现吞噬泡，细菌形成明显的复制囊泡并在巨噬细胞RAW264.7中生长繁殖，当细菌感染巨噬细胞RAW264.7 24h后，巨噬细胞RAW264.7胞膜出现崩解，有规则外形的菌团也随之破裂，并释放出细菌，因而致使了Bcl-2在感染后期出现下降趋势。

有研究表明Caspase-1激活的程序性细胞死亡是细胞限制胞内细菌感染的重要手段，嗜肺军团菌感染巨噬细胞后，可激活Caspase-11，随后通过NLRP3炎性小体和凋亡相关微粒蛋白（ASC）激活细胞内的Caspase-1[15]。本试验结果显示巨噬细胞RAW264.7感染嗜肺军团菌初期，Caspase-1表达量显著升高，后期表达量降低，由此可见嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7初期，细胞可以通过增加Caspase-1的表达从而激活细胞焦亡来限制嗜肺军团菌在其体内的增殖。

综上所述，嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7后，细胞焦亡和抗凋亡两种机制同时存在，从本试验结果来看，细菌感染初期，炎症反应比较激烈大量炎症因子分泌，激活了细胞焦亡，但是从整个嗜肺军团菌感染过程来看，细菌可以在巨噬细胞RAW264.7中增殖，说明焦亡只是感染初期的一个反应，整个感染过程还是以抗凋亡为主，嗜肺军团菌感染巨噬细胞RAW264.7后发生炎症反应的确切机制仍需下一步的研究。