原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联用对鱼源链球菌的抑菌效果

柴贝贝　姜维佳　王莉贞　胡梅　赵雨川　吴永继　司红彬

摘要：[目的]探讨原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联用对鱼源链球菌的抑菌效果，为鱼源链球菌病的综合防治提供参考依据。[方法]采用微量二倍稀释法测定原儿茶酸、绿原酸及各种抗菌药对鱼源链球菌的最小抑菌浓度（MIC），并以1/2MIC的原儿茶酸或绿原酸分别联合抗菌药诱导鱼源链球菌进行传代培养，然后使用微量棋盘稀释法测定原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联合作用后的部分抑菌浓度指数（FICI）。[结果]原儿茶酸和绿原酸对鱼源链球菌的MIC分别为2500和16000μg/mL，以1250μg/mL的原儿茶酸和3000μg/mL的绿原酸分别与痢菌净、阿米卡星、粘菌素、磺胺间甲氧嘧啶钠、克林沙星和磷霉素等抗菌药联合诱导鱼源链球菌传代后，除磺胺间甲氧嘧啶钠外，其他5种抗菌药对传代获得菌株的MIC明显降低。原儿茶酸与抗菌药配伍后的FICI分别为0.500、0.750、0.516、1.125、0.140和10.516，绿原酸与抗菌药配伍后的FICI分别为0.501、0.625、0.501、>2.000、0.140和10.501。依据FICI的判定标准可知，原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍呈协同效应，与阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍表现为无关效应；绿原酸与阿米卡星和克林沙星配伍呈协同效应，与痢菌净、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍则呈拮抗效应。[结论]原儿茶酸或绿原酸与抗菌药配伍后能增强大部分抗菌药对鱼源链球菌的抑菌活性，呈协同或相加作用，可在水产养殖生产中推广应用。

关键词：鱼源链球菌；原儿茶酸；绿原酸；联用；最小抑菌浓度（MIC）；部分抑菌浓度指数（FICI）

中图分类号：S941.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0580-06

0引言

[研究意义]当前的水产养殖技术虽已取得长足发展和明显成效，但鱼源链球菌病的防控技术尚未得到突破，仍是制约鱼类养殖业健康发展的主要病害之一（杨剑等，2015；吕小丽等，2017；辛年香和蔡延渠，2017）。据报道，2012年仅因链球菌病给罗非鱼养殖业造成的经济损失就超过10亿元（李莉萍等，2013）。目前，在鱼类养殖生产中仍以化学类抗菌药防控鱼源链球菌病为主，但这些广谱抗菌药的长期大量使用，极易促使病原菌的耐药性增强，进而对生态环境及人类健康产生极大的负面影响。因此，寻找一种既能有效防控鱼源链球菌病又能减轻对环境破坏的方法显得尤为重要。[前人研究进展]鱼源链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，其病原菌包括海豚链球菌（Streptococcus iniae）、无乳链球菌（&agalactiae）、副乳房炎链球菌（S.parau-beris）和停乳链球菌（S. dysgalactiae）等（陈明，2013；郭长明等，2017）。由于鱼源链球菌病的危害极大，因此针对鱼源链球菌的研究也不断深入。目前，国内外有关鱼源链球菌病的研究主要集中在病原菌分离鉴定、流行病学调查、检测手段、防治方法及致病机理等方面（张生等，2007；辛年香和蔡延渠，2017）。柒壮林（2012）从广西罗非鱼流行病暴发区（宜州、柳州、北海）的病鱼体内分离获得3株菌株，经细菌形态学观察和基因序列分析，确定宜州分离株为海豚链球菌，柳州和北海分离株为无乳链球菌。张德锋等（2017）通过分析2007～2015年我国罗非鱼主产区无乳链球菌的分子特征及流行情况，发现近年来我国罗非鱼源无乳链球菌发生了明显的遗传变异，且推测其主要是通过苗种或水体等介质传播，属于输入性传播方式。在鱼源链球菌病的防控方面，Al-hebshi等（2006）研究表明，阿拉伯茶水提物与四环素联用时，四环素对链球菌的最小抑菌浓度（MIC）从16 gg/mL降至4 1ag/mL；Rattanachaikunso-pon和Phumkhachom（2009）、Wu等（2013）研究證实，于疫病流行季节在基础饵料中适当添加黄芪多糖、酵母多糖、维生素C、苦参、穿心莲等免疫增强剂，能有效增强鱼体的抗病能力，减少发病死亡；刘亮（2013）研究发现，给罗非鱼投喂含1%黄连的饵料可促使其产生80%的相对保护率。[本研究切入点]原儿茶酸广泛存在于穿心莲、冬青、荭草、丹参、五味子、翻白草等常用中药和可食用蔬菜水果中，是一种水溶性酚酸成分，具有抑菌（Liu et a1.，2005）、抗癌（Yip et a1.，2006）、抗炎（Min et a1.，2010）和抗氧化（张秀丽等，2011）等药理作用；绿原酸存在于忍冬科忍冬属、菊科蒿属植物中，也具有抑菌（王宏军等，2003）、抗炎（杨斌等，2009）和抗肿瘤、抗氧化（武雪芬等，1999）等药理作用，但至今有关原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联合作用于鱼源链球菌的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]检测原儿茶酸或绿原酸与供试抗菌药联用时诱导鱼源链球菌传代的体外抑菌活性，采用微量棋盘稀释法测定配伍后的MIC，并以此计算配伍组合的部分抑菌浓度指数（FICI），判断配伍药物组合间是否存在协同或相加效应，为鱼源链球菌病的综合防治提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

鱼源链球菌由广州海大集团股份有限公司馈赠；原儿茶酸购自南京泽朗生物科技公司；绿原酸购自南京道斯夫生物科技公司；脑心浸液（BHI）琼脂培养基、血琼脂培养基、BHI营养肉汤、犊牛血清和细菌生化鉴定管均购自杭州天河微生物试剂有限公司；痢菌净（Mequindox）、阿米卡星（Amikacin）、粘菌素（Colistin）、磺胺间甲氧嘧啶钠（Sulfamonomethoxine）、克林沙星（clinafloxacin）和磷霉素（Fosfomycin）均为国产抗菌药，且在有效期内。

1.2菌株培养鉴定

取保存于30%甘油中的鱼源链球菌接种于BHI肉汤培养基（添加5%犊牛血清）中，37℃振荡培养6 h后取培养物划线接种于BHI琼脂培养基（添加5%犊牛血清）上，37℃培养12 h，从培养基上挑取白色菌落进行纯培养，然后进行菌落涂片镜检、触酶试验及血琼脂培养基培养确认其溶血特性，并按细菌生化鉴定管使用说明对纯培养所得菌株进行生化鉴定。

1.3抗菌药、原儿茶酸和绿原酸溶液制备

1.3.1抗茵药溶液制备 参照CLSI推荐的方法进行抗菌药溶液制备（刘增援，2016）。

1.3.2原儿茶酸和绿原酸溶液制备 准确称取原儿茶酸300 mg、绿原酸180 mg，分别溶于15 mEN菌水，经无菌滤头过滤所得溶液浓度：原儿茶酸20000μg/mL，绿原酸12000 Bg/mL。

1.4原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联合抗菌试验

1.4.1MIC检测 参照CLSI推荐的方法和结果判定标准（刘增援，2016），采用微量二倍稀释法测定原儿茶酸、绿原酸及各种抗菌药对鱼源链球菌的MIC。

1.4.2原儿茶酸或绿原酸联合抗菌药诱导细菌传代 以1/2MIC的原儿茶酸或绿原酸溶液分别联合抗菌药诱导鱼源链球菌进行传代培养，联合传代培养后的MIC与单独抗菌药的MIC进行比较，确定联合传代培养后的抗菌药MIC是否变小，以此判断原儿茶酸或绿原酸联合抗菌药对该耐药菌传代培养是否具有增强抑制作用。

1.4.3微量棋盘稀释法 以微量棋盘稀释法分别对原儿茶酸、绿原酸与抗菌药的组合进行二倍倍比稀释，药物互作效应通过计算其部分抑菌浓度指数（FICI）来判断，具体操作及判定标准参照NCCLS（刘增援，2016）。

FICI=MIC_A联/MIC_A+MTC_B联/MIC_B

其中，A表示抗菌药，B表示原儿茶酸或绿原酸。判定标准：FICI≤0.500表现为协同作用，0.5002结果与分析

2.1菌株培养鉴定结果

2.1.1菌株形态特征将鱼源链球菌划线接种于BHI琼脂培养基37℃培养12 h后，发现其菌株生长良好，菌落边缘整齐、呈白色（图1-A）；在血琼脂培养基上形成的菌落呈灰白色、表面光滑、边缘整齐，且呈B溶血（图1-B）。镜检发现，菌株革兰氏染色呈阳性，球形，链状排列（图1-C）。

2.1.2触酶试验结果 无菌条件下，用接种环在分离菌株的新鲜培养物中挑取菌落形态、颜色一致的单个菌落置于载玻片上，滴加少量的3%H202，未产生气泡，即判定触酶试验呈阴性。

2.1.3生化鉴定结果 以纯化获得的菌株进行生化鉴定，结果发现该菌株可水解七叶苷和精氨酸，其V-P、脲酶和马脲酸试验均呈阴性，能发酵葡萄糖、水杨苷、蔗糖和淀粉，但不发酵阿拉伯糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖和山梨醇。参照Berridge等（1998）的研究结果，可判定为链球菌。

2.2原儿茶酸、绿原酸及各供试抗菌药的MIC

采用微量二倍稀释法测定原儿茶酸、绿原酸及各供试抗菌药对鱼源链球菌的MIC，结果表明，原儿茶酸的MIC=2500μg/mL，绿原酸的MIC=6000μg/mL，因此后续试验中原儿茶酸和绿原酸的1/2MIC分别为1250和3000μg/mL。由表1可看出，各抗菌药对鱼源链球菌的MIC均很高，说明本研究选用的鱼源链球菌对这些供试抗菌药已产生耐药性。

2.3原儿茶酸或绿原酸联合各抗菌药诱导鱼源链球菌传代的结果

由表2可看出，原儿茶酸与痢菌净或克林沙星，绿原酸与阿米卡星或克林沙星联合诱导鱼源链球菌传代后，抗菌药对第一代菌株的MIC降低了200%或200%以上。原儿茶酸与磺胺间甲氧嘧啶钠联合诱导鱼源链球菌传代后，磺胺间甲氧嘧啶钠对传代获得菌株的MIC无任何变化，始终保持在3200.00μg/mL；绿原酸与磺胺间甲氧嘧啶钠联合诱导鱼源链球菌传代后，磺胺间甲氧嘧啶钠对第一代菌株的MIC反而增大，对第二、三代菌株的MIC仍保持在3200.00 μg/mL。其他药物联合诱导鱼源链球菌传代后，其抗菌药对第一代菌株的MIC均降低了100%。可见，除磺胺间甲氧嘧啶钠外，原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联合诱导鱼源链球菌传代后，均可增强鱼源链球菌对抗菌药的敏感性，降低MIC。

2.4原儿茶酸或绿原酸与抗菌药配伍的药敏试验结果

由表3可知，原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍后的FICI≤0.500，与阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍后的FICI分别为0.750、0.516和0.516，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍后的FICI为1.125；绿原酸与阿米卡星和克林沙星配伍后的FICI≤0.500，与痢菌净、粘菌素和磷霉素配伍后的FICI分别为0.501、0.501和0.563，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍后的FICI>2.000。依据FICI的判定标准可知，原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍后呈协同效应，与阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍后呈相加效应，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍表现为无关效应；绿原酸与阿米卡星和克林沙星配伍呈协同效应，与痢菌净、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应，与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍则呈拮抗效应。

3讨论

链球菌是危害水产养殖业的主要致病菌之一，可感染多种鱼类，包括罗非鱼、日本鲆、鳗鱼和虹鳟等，同时能在不同种类的鱼群间进行交叉传播，甚至还会通过伤口感染人类（Lehane and Rawlin，2000；郭长明等，2017）。目前，广西不同地区的罗非鱼源链球菌均已产生不同程度的耐药性，其中南宁地区无乳链球菌的耐药率高达100%（吕小丽等，2017），其耐药性的产生对该病的防治提出了更大挑战。已有研究表明，原儿茶酸和绿原酸对多种细菌具有抑制作用（王宏军等，2003；Liu et a1.，2005），但近年来的研究主要集中在抗炎、抗氧化、抗病毒方面，有关二者与抗菌药配伍作用于细菌的研究鲜见报道。本课题组前期的研究表明，将中药提取物与抗菌药联合使用可显著降低抗菌药的MIC，如救必应水提物与阿莫西林联合作用于产ESBLs细菌，阿莫西林的MIC从640.00 μg/mL降至80.00 μg/mL（宋剑武等，20 14）；爬山虎水提液与氟苯尼考联合作用于大肠杆菌后，氟苯尼考的MIc从500.00μg/mL降至3 1.25μg/mL（吴永继等，2015）；并通过研究其抑菌机理证实，救必应黄酮类提取物的加入可破坏大肠杆菌的细胞壁和细胞膜，影响细菌蛋白和DNA的合成，从而加速细菌凋亡或死亡（刘增援，2016）。但关于单一植物成分抑菌作用靶点的研究尚处于起步阶段，植物酚类成分的研究结果显示，表倍儿茶素通过抑制细菌外排泵的作用而提高四环素的抑菌效果（Sudano eta1.，2004），槲皮素可抑制細菌拓扑异构酶和蛋白激酶的活性（Shakrya et a1.，2011），绿原酸可破坏大肠杆菌的细胞壁和细胞膜。

本研究将原儿茶酸和绿原酸分别与抗菌药联合作用于鱼源链球菌，结果表明，除磺胺间甲氧嘧啶钠外，原儿茶酸或绿原酸与抗菌药联合诱导鱼源链球菌传代后，均可增强鱼源链球菌对抗菌药的敏感性，降低MIC，其中，原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍呈协同效应，与阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应；绿原酸与阿米卡星和克林沙星配伍呈协同效应，与痢菌净、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应。原儿茶酸和绿原酸均属于酚类化合物，鉴于二者结构的相似性，故推测本研究中呈协同和相加效应的表现是由于原儿茶酸、绿原酸与细胞壁合成抑制剂类、细胞膜合成抑制剂类、蛋白质合成抑制剂类、DNA合成抑制剂类等抗菌药有相同或相似的作用靶点。在本研究中，原儿茶酸与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍表现为无关效应，绿原酸与磺胺间甲氧嘧啶钠配伍则呈拮抗效应，与Jayaraman等（2010）研究报道原儿茶酸与磺胺间甲氧嘧啶钠联合作用于绿脓杆菌时呈协同效应的结论存在明显差异。因此，有关原儿茶酸和绿原酸的抑菌机理及其与抗菌药联用的增效或拮抗机制有待进一步探究证实，旨在更好地完善中西药配伍组合防治鱼源链球菌病的综合防控体系。

4结论

原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍呈协同效应，与阿米卡星、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应；绿原酸与阿米卡星和克林沙星配伍呈协同效应，与痢菌净、粘菌素和磷霉素配伍呈相加效应。即原儿茶酸或绿原酸与抗菌药配伍后能增强大部分抗菌药对鱼源链球菌的抑菌活性，呈协同或相加作用，可在水产养殖生产中推广应用。

（责任编辑 兰宗宝）