HPLC—DAD测定仙鹤草配方颗粒中3种成分

李军山 聂丽建

摘要：为了建立同时测定仙鹤草配方颗粒中芦丁、槲皮苷、木犀草素含量的有效方法，通过对流动相、检测波长、提取溶剂及提取方式等因素进行考察，最终确定了采用HPLC-DAD法同时测定仙鹤草配方颗粒中的3种成分，采用InertSustain AQ-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.5%醋酸为流动相，流速为0.8 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为35 ℃。结果表明，芦丁、槲皮苷、木犀草素分别在0.216～5.410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范围内呈现良好的线性关系，R2分别为0.999 5，0.999 6和0.999 7，平均回收率（n=6）分别为101.5%，1001%和99.5%。该方法快速准确，专属性强，可用于仙鹤草配方颗粒的质量控制。

关键词：色谱分析；仙鹤草配方颗粒；芦丁；槲皮苷；木犀草素；HPLC

中图分类号：R2841文献标志码：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx04011

仙鹤草（Agrimonia pilosa Ledeb）始载于《本草图经》，为蔷薇科多年生草本植物龙芽草的全草[1]，夏、秋二季茎叶茂盛时采割，常用名为脱力草、龙芽草、石打穿、狼牙草等，主产于浙江、江苏、湖北，销往全国并出口；此外，安徽、辽宁、福建、广东、河北、山东、湖南、云南等地亦产。仙鹤草性平，味苦、涩，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚等功效，用于咯血、吐血、崩漏下血、疟疾、血痢、痈肿疮毒、阴痒带下、脱力劳伤等症状的治疗[2-8]。

目前，对于仙鹤草的研究方法不一，有薄层扫描法、红外光谱和电泳法等，各方法均有优缺点。GU等[9]利用薄层色谱法测定仙鹤草成分，虽时间较短，但操作过程中受环境的影响较大，测定结果的稳定性、重复性较差；李强等[10]利用红外光谱法对仙鹤草原药材及其提取物进行了分析与鉴定，但并未对其中具体成分的含量进行测定；还有研究人员分别利用高效液相色谱法-二极管阵列检测-电喷雾离子化-串联质谱法和高速逆流色谱法对仙鹤草中的多种活性成分进行了纯化分析[11-12]，但利用HPLC法同时测定仙鹤草配方颗粒中多种成分的相关研究尚未见报道。本实验采用HPLC-DAD法，同时测定仙鹤草配方颗粒中芦丁、槲皮苷、木犀草素3种成分的含量，以提高仙鹤草配方颗粒的质量标准[13-16]。

1主要仪器与试药

日本岛津LC-20AT、Agilent1260型高效液相色谱仪。

仙鹤草配方颗粒（神威药业集团有限公司提供，批号分别为15100211，15122111，15122611，16030411，16031411，16032711）；芦丁（批号为100080-201610）、槲皮苷（批号为111538-201606）、木犀草素（批号为111520-201605）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，天津科密欧试剂有限公司提供）；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：InertSustain AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长为360 nm，柱温为35 ℃，流速为0.8 mL/min，流动相梯度洗脱条件见表1。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液

精密称取芦丁对照品10.73 mg，置于50 mL量瓶中；精密称取槲皮苷对照品9.27 mg，置于50 mL

量瓶中；精密称取木犀草素对照品14.72 mg，置于100 mL 量瓶中。加入80%（体积分数，下同）甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取5 mL，置于同一50 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，即得。

2.2.2供试品溶液[17-19]

取仙鹤草配方颗粒，研细，称取约1.00 g，置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，精密称定，超声30 min，放冷后用80%甲醇补足质量，过滤，取续滤液即得。

2.3专属性试验

取上述供试品、对照品和阴性样品溶液，按照“21”项条件测定，结果见图1。各成分的理论塔板数（n=5.54（t/w1/2）2，n为理论塔板数，t为相对保留时间，w1/2为半峰宽）及分离度（R=2（t2-t1）/（w1+w2），R为分离度，t1和w1分别为相邻色谱峰的前一峰的相对保留时间及峰宽，t2和w2分别为相邻色谱峰的后一峰的相对保留时间及峰宽）见表2。

2.4线性关系考察

取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样1，5，10，15，20，25 μL，以进样量（x，μg）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行回归，得到回归方程（n=6）如下。

芦丁：y=1 051.1x-2 027.9（R2=0.999 5）；

槲皮苷：y=904.91x-4 160.9（R2=0.999 6）；

木犀草素：y=4 646x-1 116.8（R2=0.999 7）。

结果表明：蘆丁、槲皮苷、木犀草素在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.5精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测定芦丁、槲皮苷、木犀草素的峰面积，结果见表3，结果表明仪器的精密度良好。

2.6稳定性试验

取供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，于0，3，6，12，18，24 h 进样，进样量10 μL，测定芦丁、槲皮苷、木犀草素的峰面积，结果见表4。由表4可以看出，供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性试验

精密称取同一批号样品6份（批号为14100211），每份0.5 g，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件测定芦丁、槲皮苷和木犀草素的峰面积，结果见表5。由表5可以看出，该方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验

称取同一批仙鹤草配方颗粒，研细，按“2.2.2”项方法各称取约1.00 g，平行制备3份样品，测定各成分含量；再称取3組9份仙鹤草配方颗粒样品，各加入一定量的对照品，分别进样分析，结果见表6。结果显示，芦丁、槲皮苷和木犀草素的平均回收率分别为101.5%，100.1%和99.5%。

2.9耐用性试验

用依利特Sinochrom ODS-BP （250 mm×4.6 mm，5 μm） 和Thermo Sciences BETASIL C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm） 色谱柱在2台高效液相色谱仪（岛津LC-20AT和Agilent1260） 上进行耐用性试验考察，测定其峰面积，结果见表7。结果表明，2个厂家的液相色谱仪和2种色谱柱均可满足试验要求，耐用性良好。

2.10样品含量测定

取6批样品，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件测定，结果见表8。

2.11检测限与定量限

取“2.2.1”项对照品贮备液，逐级稀释后进样，以色谱峰峰高为基线噪音3倍进行计算，芦丁、槲皮苷和木犀草素的检测限分别为1.460，0.440和1064 ng；以色谱峰峰高为基线噪音10倍进行计算，定量限分别为4.380，1.320和3.192 ng。

3讨论

3.1流动相的选择

芦丁、槲皮苷和木犀草素的检测流动相大多采用乙腈-磷酸、醋酸溶液或乙腈-水，也有用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸或甲醇-水溶液。采用甲醇时，各色谱峰的分离度及峰型对称情况较差。本实验对比了乙腈-磷酸水溶液及乙腈-不同浓度的醋酸水溶液，发现以乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相洗脱时，基线不稳且槲皮苷的分离度较低；以乙腈-水为流动相时，色谱峰个数减少；以乙腈-0.5%醋酸水溶液为流动相时，4种被测成分都能得到很好的分离。故本实验以乙腈-0.5%醋酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱方式，使3种成分均有合适的保留时间和较高的分离度。

3.2检测波长的选择

通过对对照品溶液进样分析的全波长扫描图进行分析，发现芦丁在255 nm和354 nm波长处有较大吸收，槲皮苷在255 nm和349 nm波长处有较大吸收，木犀草素在252 nm和348 nm波长处有较大吸收，3种成分的全波长扫描图见图2。综合考虑，本实验选择360 nm作为检测波长，色谱图基线平稳，杂峰少，各成分均有较高响应，在上述实验条件下定量准确，回收率较高。

3.3提取方法的选择

本实验考察了超声提取、索氏提取、回流提取等方式，研究了回流时间和超声时间。结果显示，3种提取方法差异较小，超声时间小于20 min时测定结果偏低，而在30 min以上时较为稳定。因此，选择超声30 min作为提取方法。

3.4提取溶剂的选择

用纯甲醇、乙醇、水及不同比例的甲醇溶液作为提取溶剂进行实验，发现纯甲醇对极性较大的成分提取效果差，乙醇对各种成分的提取效果均不佳，水对极性较小成分的提取效果差，40 min后出峰成分提取效率极低，20%的甲醇对40 min后出峰的成分提取效果亦不佳。对比分析50%和80%甲醇作为提取溶剂的提取效果，发现80%甲醇提取的芦丁、槲皮苷、木犀草素的峰型及分离度最好、基线最优。因此，最终确定以80%的甲醇作为提取溶剂。

4结语

利用HPLC法同时测定仙鹤草配方颗粒中的多种成分目前尚未见报道。本实验通过对流动相、检测波长、提取溶剂及提取方式等进行考察，最终确定了采用HPLC-DAD法同时测定仙鹤草配方颗粒中的3种成分，以乙腈-0.5%醋酸为流动相，流速为0.8 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为35 ℃。结果表明，芦丁、槲皮苷、木犀草素分别在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范围内呈现良好的线性关系，R2分别为0.999 5，0.999 6和0999 7，平均回收率（n=6）分别为101.5%，1001%和99.5%。该方法快速准确，专属性强，可用于仙鹤草配方颗粒的质量控制。

仙鹤草中含有芦丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素等多种黄酮类成分，此类成分具有抗心律失常、抑制乙酰胆碱酯酶、降糖等多种药理作用。本文仅对3种成分进行了同时测定，未来应继续深入研究仙鹤草配方颗粒中的其他黄酮类成分，以保证临床疗效。

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