36种中药材体外抗菌活性筛选研究

胡欢 左国营 张泽萍

摘 要：該文研究36种常用中药材80%乙醇提取物在体外抗临床常见致病菌的抗菌活性。采用药敏纸片法测耐药菌的耐药谱，中药粗粉用80%乙醇浸泡提取，提取液减压浓缩得浸膏，通过琼脂打孔法测定提取物抑菌圈，再通过微量倍比稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果表明：36种中药材醇提物中，有15种具有广谱抗菌活性，对实验中各标准菌表现出不同程度的抑制作用，对MRSA抗菌活性也较强。其中，岩陀、卷柏、首乌藤、苏木、乌药、夏枯草6种药材的抗菌活性比较突出，抑菌圈均大于11 mm，细菌对其表现为中高度敏感；它们对7株标准菌的MIC/MBC值除个别为12.5 mg·mL-1以外，均小于1.563 mg·mL-1，对16株MRSA的MIC/MBC值均小于1.563 mg·mL-1，它们的萃取层活性均小于1 mg·mL-1。所筛选出的15种抗菌活性较强的中药材，可为后续研究其活性单体化合物和作用机制，研发有效的抗多重耐药菌的中药制剂以及解决细菌耐药性问题提供一定的参考。

关键词：中药材， 金黄色葡萄球菌， 大肠埃希菌， 白色念珠菌 ， 铜绿假单胞菌， 抗菌活性， 最低抑菌浓度， 最低杀菌浓度

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）04-0428-13

Abstract：To determine the in vitro antimicrobial activities of 80% ethanol extracts from 36 common Chinese herbal medicines against common clinical pathogenic bacteria. The spectrum of multidrug-resistant clinical stains isolated from the sputum samples was determined by the Kirby-Bauer （K-B） method. The dried powder of the collected 36 Chinese herbal medicine samples were extracted with 80% ethanol and the solvent was evaporated under reduced pressure to get the ethanol extracts. The antimicrobial activities of each extract against bacteria or fungi were studied by screening inhibition zone diameters （IZDs） with agar-diffusion methods， and minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） were determined by serial microdilution method. The results showed that ethanol extracts of fifteen species among 36 species selected had wide spectrum of antimicrobial activities， including the activity against MRSA. Six kinds of Chinese herbal medicines had obvions antibacterial activities， i.e. Bergenia purpurascens， Selaginella tamariscina， Polygonum multiflorum， Caesalpinia sappan， Lindera aggregata and Prunella vulgaris. Their IZDs were greater than 11 mm and the bacteria showed moderately and highly sensitivity. The MIC/MBCs against seven standard strains were mostly less than 1.563 mg·mL-1， in addition to 12.5 mg·mL-1 individually. The MIC/MBCs against sixteen strains of MRSA were also less than 1.563 mg·mL-1， and their sub-extracts were less than 1 mg·mL-1. The fifteen species screened out among commonly used Chinese herbal medicines with good antibacterial activities could provide a basis for the subsequent activity tracking of isolated components， for the study on antibacterial mechanism and exploring effective Chinese medicine preparations against multiple resistant bacteria， and for solving the problem of bacterial resistance.

Key words：Chinese herbal medicines， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Candida albicans， Pseudomonas aeruginosa， antibacterial activity， minimum inhibitory concentration， minimum bactericidal concentration

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大肠埃希菌（Escherichia coli，EC）、白色念珠菌（Candida albicans，CA）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA） 均是医院和社区感染常见的致病菌。SA现已成为全世界医院内首要的致病菌，尤其是出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）等多重耐药菌。MRSA 具有较高的感染率和致死率，成为所谓的“超级细菌”，被列为世界范围内最难解决的感染菌之一（Patel， 2009；Foster et al， 2014）。EC在自然环境中广泛存在，是哺乳动物小肠内的共生菌，但其又是条件致病菌，致病性的EC能引起人类及动物的感染（Blanco et al， 2003）；能通过多种感染渠道导致EC感染疫情大规模爆发，其耐药性的出现引起了广泛担忧（卫昱君等，2016）。CA是一种寄生在正常人口腔、呼吸道、消化道及生殖道等部位的机会性致病真菌，常可能引起浅表或深部的感染，严重者可引起系统性感染甚至危及生命（Gow et al， 2012）。PA的感染仅次于大肠埃希菌、克雷伯菌等常见病原菌，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播（吴明权等，2016）；临床上常见于尿路感染、呼吸道感染和免疫力低下的病人痰液、尿液中，甚至会引起严重的囊性纤维化病（Pier，2002）。

由于全球范围内抗生素的不合理应用，细菌耐药性对人类的危害越来越严重，且有不可抑制的趋势。在化学药抗生素相对匮乏的今天，人们把更多的目光投向了来源广泛、安全性高、毒副作用小、价格低廉、抗耐药机制独特的中草药，积极研发新型的“中药绿色抗生素”，希望能从中找到解决耐药性问题的新思路、新途径。所以近年来筛选、提取、分离天然植物及中草药中有效的耐药抑制剂或抗菌活性成分，探讨其抗耐药性机制，已成为药学领域研究的热点（韩飞等，2016）。本研究通过研究36种中草药对上述四种标准菌以及MRSA耐藥菌的体外抑制作用，以筛选出抑菌活性较好的中草药，为后续研究其活性单体化合物，开发有效的抗多重耐药菌的中药制剂缓解细菌耐药性问题，提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料和菌株

1.1.1 材料 受试中药材种名及序号见表1。1-12购买于云南省昆明市螺蛳湾中药材市场，13-36由成都军区昆明总医院中药房提供。培养基：M-H琼脂培养基 （Mueller-Hinton Agar，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司， 批号为20160217）， M-H肉汤培养基（MH Broth，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司， 批号为20151225），用于细菌体外抑菌实验；液体沙氏培养基（Liquid Sabourand Medium，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为20160822），沙氏琼脂培养基（Sabourauds Agar，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为20160811），用于真菌体外抑菌实验。试剂：NaCl （四川西陇化工有限公司，批号为20151219），二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，利安隆博华（天津）医药化学有限公司，批号为20151009），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为工业级（重新蒸馏后使用），均购自昆明福海达化玻仪器有限公司。

1.1.2 菌株 标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC 25913、ATCC 25923、ATCC 29213）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、白色念珠菌（ATCC Y0109、ATCC SC5314），均由中国药品生物制品检定所提供。耐药菌株：MRSA111、MRSA747、MRSA181、MRSA23、MRSA42、MRSA285、MRSA128、MRSA300、MRSA166、MRSA8、MRSA98、MRSA15、MRSA202、MRSA187、MRSA40、MRSA22均由成都军区昆明总医院微生物实验室临床分离得到。药敏纸片购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药物提取物的制备 将36种中药材粉碎并过50目筛，各称取30 g。用80%的乙醇室温下共浸泡6次：第1次浸泡7 d；第2、第3次浸泡5 d；第4、第5次浸泡3 d；第6次浸泡1 d。每次浸泡液经6层纱布过滤，合并滤液，用减压旋转蒸发仪浓缩（温度控制在40 ℃以下）得到浸膏，用结晶刀转移至无菌玻璃瓶中，4 ℃下封口保存备用。其中，部分药物浸膏依据所测抗菌活性选择活性较好的用蒸馏水分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层四个萃取层，减压回收得到各个萃取层的浸膏备用。

1.2.2 耐药菌株耐药谱的测定 耐药菌株的药敏测定以常规方法培养，耐药性按抗菌剂药敏常用测试方法 K-B 纸片扩散法（Kirby-Bauer diffusion method）进行（各操作均于超净工作台中进行，下同），以 Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）2012 版（CLSI：M02-A11， 2012）推荐方法为判断依据。

1.2.3 药液的制备 用电子分析天平精确称取乙醇提取物各 150 mg于4 mL离心管中，先加入含 10% DMSO 于漩涡混合器上助溶（或超声助溶），然后再加入生理盐水配成浓度为 50 mg·mL-1 的药液用于测定抑菌圈、MIC，10% DMSO 作为空白对照。萃取层则是各称取32 mg于2 mL离心管中，先加入含 10% DMSO 于漩涡混合器上助溶，再加入生理盐水配成浓度为 16 mg·mL-1 的药液用于测定MIC ，10% DMSO 作为空白对照。

1.2.4 菌悬液的制备 将细菌菌株接种于琼脂平板上，细菌接种于M-H琼脂培养基上，真菌接种于沙氏琼脂培养基上，置于（35±2） ℃ 恒温箱中培养24 h。采用0.5号麦氏比浊管仔细对比调整细菌浓度为 1.5×108 CFU·mL-1，真菌用细胞计数板在显微镜下观察调整浓度为1.0×106 CFU·mL-1，此浓度菌悬液用于琼脂打孔法测定提取物的抑菌圈；取一定量上述菌悬液，用生理盐水稀释，细菌稀释300倍为0.5×106 CFU·mL-1，真菌稀释100倍为1.0×104 CFU·mL-1，用于 MIC 的测定。

1.2.5 琼脂打孔法测定提取物的抑菌圈 首先，将已灭菌的琼脂培养基（细菌用M-H琼脂培养基，真菌用沙氏琼脂培养基）倒入灭过菌的培养皿上（厚度约 3 mm）。然后，在培养基上用直径6 mm的无菌打孔器打孔，用无菌棉签蘸取浓度为1.5×108 CFU·mL-1的标准细菌菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基上，浓度为1.0×106 CFU·mL-1 的标准真菌菌液均匀涂布在沙氏琼脂培养基上，每孔加入50 mg·mL-1的药液 50 μL，不得溢出。最后，将培养皿置于（35±2）℃恒温箱中培养 24 h后取出观察结果，用卡尺测量抑菌圈的直径并记录，平行实验3次，取平均值。

1.2.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定 微量倍比稀释法测定 MIC，均按照 CLSI 2012版指南进行（CLSI：M07-A9， 2012）。 采用微量倍比稀释法测定各个样品对不同菌株的活性即MIC值（赵婷等，2012；吴盘红等，2012）（细菌用M-H肉汤培养液，真菌用液体沙氏培养基）。首先取无菌 96 孔平底微量培养板，用8通道移液枪加入培养液 100 μL；然后在第1行每孔依次加入受试药物100 μL，混匀后取出 100 μL 移至第2行中，以此类推，进行倍比稀释直至第8行混匀后弃掉 100 μL，使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比降低；最后加入细菌或真菌的稀释菌悬液 100 μL。设含10% DMSO 相应培养液100 μL 加相应菌悬液100 μL 作陽性空白对照，相应液体培养液200 μL 作阴性空白对照。将培养板置于（35±2）℃恒温箱中培养24 h后取出观察结果，测定其MIC值。在显微镜下涂片观察，视野中细菌或真菌个数小于5个时作为此药物对此种菌的MIC对应孔，记录此孔药物浓度即为MIC值。平行实验3次，取平均值。

1.2.7 最低杀菌浓度（MBC）的测定 确定 MIC 后，用接种环分别蘸取 MIC值对应孔前3～5孔的培养液，转接种于相应琼脂平板上（细菌用M-H琼脂培养基，真菌用沙氏琼脂培养基），置于（35±2）℃恒温箱培养24 h后取出观察结果。用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落，平均数小于 5 个的最小药物浓度即为此药物对此种菌的MBC。平行实验3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 耐药谱测试结果

通过对16株临床分离的MRSA的药敏测试，从表2可以看出，16株菌除对万古霉素均敏感外，对其他各类抗生素均有不同程度的耐药， 且大多表现为多重耐药。

2.2 抑菌圈的测定结果

通过琼脂打孔法测定各药材的抑菌圈，如表3所示。根据药理学方法判定：抑菌圈直径d <10 mm 为细菌对药物表现为耐药；d =10 mm 为轻度敏感；11≤ d ≤15 mm 为中度敏感；d ≥16 mm 为高度敏感。36种中药材的醇提物对各标准菌表现出不同程度的抑制作用，对于SA，苏木和乌药的抑菌圈d均大于16 mm表现为高度敏感具有强抑制作用，岩陀、首乌藤、卷柏、夏枯草、香叶、金钱草抑菌圈11≤ d ≤21.5 mm为中高度敏感具有较强抑制作用，白及、侧柏叶、木瓜、干姜为轻中度敏感；对于EC，苏木、乌药、岩陀、首乌藤、夏枯草、香叶、金钱草、侧柏叶、五味子、秦皮、沉香（二级）的抑菌圈d均大于16 mm为高度敏感具有强抑制作用，卷柏、白及、木瓜、干姜、山茱萸、藁本、柴胡、竹茹、茜草、胡黄连、川续断抑菌圈11≤ d ≤15 mm为中度敏感具有较强抑制作用；对于PA，首乌藤抑菌圈d=16 mm为高度敏感，苏木、乌药、岩陀、山茱萸抑菌圈11≤ d ≤15 mm表现为中度敏感具较强抑制作用，其余药材抑菌效果均不明显；36种中药材对CA的抑制效果均不明显。10%DMSO抑菌圈不明显 ，表明10%DMSO对该菌没有抑菌活性或抑菌活性不强，不影响实验结果。

2.3 MIC和MBC测定结果

通过微量倍比稀释法分别测定了药物提取物和提取物萃取层对各标准菌或MRSA耐药菌的抗菌活性。所测各组实验中，阳性对照显示细菌长势良好，排除10%DMSO 对实验的干扰；阴性对照显示无细菌生长，表明该实验操作规范、无污染、数据有效。

表4结果表明，苏木、卷柏、夏枯草、岩陀、乌药、侧柏叶、金钱草、香叶、秦皮、五味子、山茱萸、茜草、沉香（二级）、狼毒大戟、南沙参15种药材对四种标准菌都有不同程度的抑制作用，具有广谱的抗菌活性。其中，苏木、卷柏、夏枯草、岩陀、首乌藤、乌药6种中药提取物对SA和EC的MIC/MBC值均在0.098～0.781 mg·mL-1之间，说明抗菌活性很好。

根据表4结果，选取抑菌活性较好的9种药材提取物萃取后，各萃取层对标准菌的MIC/MBC测定结果如表5所示，各药乙酸乙酯层的抑菌活性均比其他萃取层的显著，说明这些药材的有效抗菌活性成分主要集中在乙酸乙酯层萃取物中，为后续天然化合物的分离提供了活性追踪分离导向。同时，选取其中24种抗菌活性较好的中药材，对16株MRSA耐药菌进行体外抗菌活性测定。表6结果显示，除鸡蛋花、狼毒大戟、胡黄连外，其他21种中药提取物对MRSA都有不同程度的抗菌活性，抑菌作用良好；其中岩陀、苏木、乌药、侧柏叶、卷柏、夏枯草、沉香（二级）、首乌藤、白及、香叶、五味子、沉香（特级）12种中药材抗菌活性较为显著。

3 讨论与结论

随着细菌耐药性问题的日趋严峻，中药作为潜在的新型绿色的细菌耐药抑制剂愈来愈受到人们的关注。中草药在我国医药界已有几千年的历史，与化学药物相比，中草药大多为复方组分群，各成分之间具有一定相互关系，通常表现为整体量效作用，并非简单作用于某一个单一的靶点，所以不容易产生耐药性。其来源广泛、安全性高、毒副作用小、价格低廉，并具有与化学药物不同的抗菌作用机制，成为了细菌耐药性研究领域的热点，具有良好的应用前景（韩飞等，2016）。

中草药抗细菌耐药性的研究仍然处在初级阶段，还有更多的问题等待我们去研究和探讨。用于延缓或消除细菌耐药性的中草药多为清热解毒、清热燥湿、利湿通淋、补益类中药，如黄芩、黄连、黄柏、金银花、马齿苋、射干、大黄、苍术、蒲公英、鱼腥草、汉防己、五倍子等；以及相关的复方制剂，如止痢灵、三黄片、双黄连粉针剂、黄连解毒汤、白虎汤、蒲公英解毒汤、清瘟败毒饮、十全大补汤、补中益气汤等（李睿明和雷朝霞，2006；杭永付等，2011）。

本研究通过查阅文献和中国医学典籍，总结长期临床医学实践及前人研究情况，选取了36种常见的具有一定抗菌、解毒作用基础的中药材，研究其乙醇提取物的抗菌作用。实验中所使用的耐药菌株均是从本院临床重症患者的痰液中分离得到，这16株耐药菌株对临床上现有使用的多种抗生素产生了耐药性，因此，抗生素用于临床治疗中可以充分结合药敏试验的结果，合理用药， 尽量避免耐药，以提高治疗效果。本研究结果显示，综合抑菌圈和MIC/MBC数据得出苏木、卷柏、乌药、岩陀、首乌藤、夏枯草、侧柏叶等15种中药材抗菌活性较强；比较同一种中药材醇提物对标准菌和耐药菌的抗菌活性，可看出对标准菌抗菌活性强的药材，对耐药菌抗菌活性也强，说明中草药确实在抗耐药性问题上具有一定的优势，如卷柏对各标准菌抑菌圈9.50≤ d ≤21.50 mm，为中高度敏感，具有较强抑制作用；抗菌活性测定中，其乙醇提取物对各标准菌均有较强抗菌活性，对于SA和EC 其MIC和MBC值均在<0.098～0.781 mg·mL-1之间，对PA和CA其MIC和MBC值均为12.5 mg·mL-1；对MRSA也表现出较强的抗菌活性，MIC值在0.098～3.125 mg·mL-1之间，MBC值在0.195～6.25 mg·mL-1之间。从药材提取物萃取层的抗菌活性测定结果可知，各药材乙酸乙酯层的抑菌活性均比其他萃取层的显著，说明这些药材的有效抗菌活性成分主要集中在乙酸乙酯层萃取物中，为后续天然化合物的分离提供了活性追踪分离导向。此次通过体外抗菌活性实验，研究了36种常见中药材的体外抗菌作用情况，对所选中药材进行了初步筛选。

目前关于这36种常见中草药抗细菌耐药性的研究报道较少，继续开展广泛而深入的细菌耐药性延缓或消除的相关研究，对合理开发和利用中药资源具有很重要的现实意义。本研究是关于中草药对单一纯培养菌群的体外筛选研究，其优点是实验条件明确，操作和结果分析也比较容易，但缺点是抗菌活性成分和相关抑菌机制并未明确，故本课题今后将进行活性追踪分离，分离筛选出具有良好抗菌活性的中草药单体成分，尝试探究其作用机制并将活性单体成分联合抗生素进行抗菌活性试验，以期达到增效减毒的治疗目的，希望为后续一系列解决细菌耐药性问题的研究提供一定参考。

参考文献：

BLANCO M， BLANCO JE， MORA A， et al， 2003. Serotypes， virulence genes， and intimin types of Shiga toxin（verot-oxin）-producing Escherichia coli isolates from healthy sheep in Spain [J]. J Clin Microb， 41：1351-6.

Clinical and Laboratory Standards Institute， 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M02-A11. Wayne， PA：CLSI2012.

Clinical and Laboratory Standards Institute， 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M07-A9. Wayne， PA：CLSI2012.

FOSTER TJ， GEOGHEGAN JA， GANESH VK， et al， 2014. Adhesion，invasion and evasion：The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus [J]. Nat Rev Microbiol， 12（1）：49.

GOW NAR， VAN DE VEERDONK FL， BROWN AJP， et al， 2012. Candida albicans morphogenesis and host defence：discriminating invasion from colonization [J]. Nat Rev Microbiol， 10（2） ：112.

HAN F， XING RH， CHEN LQ， et al， 2016. Research progress of anti-drug resistance in traditional Chinese medicine [J]. Chin J Chin Mat Med， 41（5）：813-817. [韓飞，幸仁汇，陈琳琦，等，2016. 中药抗细菌耐药性的研究进展 [J]. 中国中药杂志，41（5）：813-817.]

HANG YF， XUE XY， FAN GY， et al， 2011. Progress of traditional Chinese medicine antibacterial and reversal of drug resistance mechanism [J]. J Chin Pharm， 22 （47）：4504-4507. [杭永付， 薛晓燕， 方芸， 等， 2011. 中药抗菌和逆转耐药作用机制研究进展 [J]. 中国药房，22（47）：4504-4507.]

LI RM， LEI ZX， 2006. Tactics for prewtion of bacterad resistance [J]. Med Phil （Clin Dec Mak For Ed）， 27（8）：45-47. [李睿明， 雷朝霞， 2006. 细菌耐药性对抗决策 [J]. 医学与哲学（临床决策论坛版），27（8）：45-47.]

PATEL M， 2009. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus infections epidemiology [J]. Recogn Manag Drugs， 69：693-716.

PIER GB， 2002. CFTR mutations and host susceptibility to Pseudomonas aeruginosa lung infection [J]. Curr Opin Microbiol， 5（1）：81-86.

WEI YJ， WANG ZT， XU YC， et al， 2016. Current situation analysis and detection techniques of pathogenic Escherichia coli [J]. Biotechnol Bull， 32（11）：80-92. [卫昱君， 王紫婷， 徐瑗聪， 等， 2016. 致病性大肠杆菌现状分析及检测技术研究进展 [J]. 生物技术通报，32（11）：80-92.]

WU MQ， WEI SZ， HUANG YQ， et al， 2016. Study on drug resistance mechanism of Pseudomonas aeruginosa and its countermeasures [J]. Eval ANal Drug-Use Hosp Chin， 16（11）：1460-1461. [吴明权， 魏士长， 黄银秋， 等， 2016. 绿脓杆菌耐药机制及其对策研究 [J]. 中国医院用药评价与分析，16（11）：1460-1461.]

WU PH， XIE T， FAN RQ， et al， 2012. Experimental study on Xianglian lotion on the synergistic effect of miconazole nitrate against Candida albicans in vitro [J]. J Diagn Therapy Dermatol-Venereol， 19（3）：142. [吳盘红， 谢婷， 范瑞强， 等， 2012. 香莲外洗液对硝酸咪康唑抗白念珠菌增效作用的体外实验研究 [J]. 皮肤性病诊疗学杂志，19（3）：142.]

ZHAO T， YAO S， LI H， et al， 2012. CLSI M38-A2 broth dilution method against bat moth Paecilomyces hepiali [J]. Microbiol Chin， 39（7）：965-970. [赵婷， 姚粟， 李辉， 等， 2012. CLSI M38-A2肉汤稀释法对蝙蝠蛾拟青霉的药敏检测 [J]. 微生物学通报，39（7）：965-970.]