美国西部不同地区Grayia spinosa核DNA ITS序列分析

成彩霞 苏雪 高婷 周璇

摘 要：藜科植物Grayia spinosa是美國西部地区的特有种，多生长在干旱盐碱地，具有重要的生态价值。该研究测定了采自美国西部犹他州G. spinosa 的nrDNA ITS序列，与GenBank中已提交的G. spinosa 的所有ITS序列以及G. spinosa的四个近缘种作为外类群进行比较，分析了美国西部不同地区G. spinosa ITS序列的一级结构与其RNA二级结构的变异规律。结果表明：所有G. spinosa样品的nrDNA ITS序列长度在611～623 bp之间，GC含量在60.35%～61.0%之间，序列间共存在22个变异位点，5个为简约信息位点。各样品间的遗传距离在0.001 8～0.008 9之间，不同样品间的遗传距离与地理距离的相关性不显著。邻接法构建的系统发育树显示所有G. spinosa聚为一大支，与外类群形成明显分支。此外，利用RNAfold在线软件预测了G. spinosa ITS序列的RNA二级结构，将8个G. spinosa 样品的RNA二级结构根据构型差异大体上分为四类，分别记为type A，B，C和D四类，主要变异出现在ITS1和ITS2区。所不同的是在G. spinosa ITS的一级结构分析中GSNE1与GSWA8体现出更近的亲缘关系，但二者的RNA二级结构差异明显，同时GSNE2、GSUT3、GSUT4、GSCA5、GSCA6、GSCO7在ITS序列一级结构分析中也体现出较近的亲缘关系，但是他们的RNA二级结构差异明显。这可能与ITS序列的RNA二级结构在进化中体现出更大的保守性有关。

关键词：Grayia spinosa，ITS 序列变异，二级结构，藜科

中图分类号：Q949.745.1

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）05-0617-09

Abstract：Grayia spinosa，a species endemic to the Western United States，is mainly distributed in arid and saline areas and has important ecological value. ITS sequence of G. spinosa collected from Utah State of the United States was sequenced，and aligned with other sequences from GenBank of this species by Blast. The relationship among G. spinosa from the West United States were analyzed based on ITS sequences and four related species of Grayia were selected as outgroup. ITS sequence variation of G. spinosa and its RNA secondary structure was analyzed in different regions of the United States. The results showed that the length of ITS sequences ranged from 611 bp to 623 bp and the GC contents was 60.35%-61.0%. There were 22 variants sites and five parsimony informative sites in the ITS sequences of G. spinosa from different regions in the United States. Genetic distance ranged from 0.001 8 to 0.008 9 between samples，the correlation was not significant between genetic distances and geographical distances of different samples. The phylogenetic tree constructed by Neighbor-joining method indicated that all samples of G. spinosa were clustered together，forming a distinct branch with the outer group. In addition，the RNA secondary structure of G. spinosa ITS sequence was predicted by RNA fold online software. The RNA secondary structure of G. spinosa samples were roughly divided into four types according to the configuration differences，which were named type A，B，C and D. Unlike the primary structure analysis of G. spinosa ITS sequences，RNA secondary structure did not reflect the more related phylogenetic relationships between GSNE1 and GSWA8. GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6 and GSCO7 indicated closer phylogenetic relationships in the primary structure analysis of ITS sequences，but their RNA secondary structures were significantly different，which was related to the higher conservation of RNA secondary structure.

Key words：Grayia spinosa，ITS sequence variation，secondary structure，Chenopodiaceae

藜科植物是被子植物的大科之一，是干旱、荒漠生态环境中的主要植物类群，全球共有130 属，约1 500种。我国的藜科植物资源相当丰富，尤其是在以干旱、盐碱土为主的西北部大面积生态脆弱区，藜科植物成为其植被的最重要构成部分之一，具有十分重要的生态维持与建设价值。参考中国植物志英文版发现，猪毛菜属、盐爪爪属、碱蓬属等为我国西北地区的主要藜科植物，这些类群大多为草本，植株低矮、叶片较小，花很小无观赏性，生长于农田周围或城市绿化区域，而且多以杂草对待。Grayia spinosa为藜科中少有的灌木，植物体较大，寿命长，花被红色、大而鲜艳，不同于大多数藜科植物，具有一定的观赏价值。此外，G. spinosa耐干旱、盐碱及贫瘠的能力极强，是植被恢复重建的极好材料，但仅分布于北美，美国西部是它最重要的分布区。

近年来，随着分子标记技术的迅速发展，DNA序列分析被广泛应用于植物系统发育分析和遗传多样性研究。与此同时，由这些分子标记所揭示的DNA等生物大分子的变异式样及特征成为了研究了解一个物种的最为基本和重要的环节，并为进一步的科学研究提供基础。核DNA ITS序列是介于18S至26S之间的非编码内转录间隔区，包含一个5.8S编码区，由于ITS序列在进化过程中受到的选择压力小且进化速率较快等特点，被广泛用于属及种水平等较低分类阶元亲缘关系和系统进化研究（Jaehav & Shama，2014；Liang & Wu，2017；Guo et al，2016）。近年来，ITS序列也开始应用于种内系统关系的研究和药用植物真伪品鉴定等方面（蒋玲艳和郭志刚，2009；Chen et al，2010；Khan et al，2014）。同时，ITS序列虽然在部分区域出现较高的突变率，却可能会通过碱基补偿替换等方式抵消这些位点的突变对二级结构的干扰，使得在进化过程中其RNA二级结构体现出更大的保守性。因此，本研究通过对美国西部不同地区G. spinosa的ITS序列一级结构及其RNA二级结构的分析，以期了解以下问题：（1）不同G. spinosa样品 ITS序列的变异规律。（2）G. spinosa ITS一级结构与其RNA二级结构的变化是否一致？

1 材料

鉴于该研究的主要目的是探讨G. spinosa分布范围内不同区域ITS序列的变异样式，取样地点的选择以涵盖其主要分布区为准，并且在每个地区尽可能取2～3个不同地点的材料，凡NCBI已有记录的样点不再另行采样而直接下载其序列的相关信息（包括分布在科罗拉多、加利福尼亚、内华达、华盛顿和犹他州等G. spinosa主要分布区的所有G. spinosa ITS序列共7个样品）。样品GSUT4由朱格麟教授采自犹他州一野外居群，叶片干燥后测序。另外，选择与G. spinosa亲缘关系较近的G. brandegeei、Holmbergia tweedii、Atriplex joaquinana和Chenopodium fremontii为外类群，它们的来源、产地和序列登录号见表1。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取

对采自犹他州的G. spinosa样品用变色硅胶干燥储藏，带回实验室后采用改良的CTAB法（Doyle，1987）提取基因组总DNA。

2.2 ITS序列的PCR扩增

采用ITS通用引物，即ITS1（5′AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GC 3′）和 ITS4（5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′）。PCR反应总体系为20 μL，其中PCR Mix（宝生物公司）10 μL，上下游引物（20 μmol·L-1）及DNA模板各1μL，加ddH2O 至 20 μL 。扩增程序：（1）70 ℃预变性4 min；（2）94 ℃变性1 min，退火温度52 ℃，退火1 min；（3）72 ℃延伸1 min，循环35次；（4）保持72 ℃ 4 min；（5）4 ℃保存PCR产物。

2.3 PCR产物检测与测序

PCR产物在经过琼脂糖凝胶电泳、EB（溴化乙锭）染色、在紫外灯检测后，送苏州金唯智公司进行测序（为双向测序，结果进行互相验证）。

2.4 数据处理

利用NCBI中的Blast进行序列比对，并选择与G. spinosa亲缘关系近的四个种作为外类群。用DNAstar软件包中的EditSeq计算ITS序列长度与GC含量，用DNAman计算遗传距离，R软件包vegan做Mantel检验。用Mage6.0计算变异位点、简约信息位点并用邻接法构建系统发育树（利用1 000次重复的自展分析检验各分支的置信度）。利用RNAfold（RNA二级结构在线预测软件，http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）预测G. spinosa的 ITS序列的RNA二级结构，该软件采用最小自由能原理，参数设为默认值。

3 结果与分析

3.1 PCR产物电泳结果

利用1.5%的琼脂糖电泳检测PCR产物，结果见图1。ITS序列条带清晰，与DL2000 bp的DNA Marker比对后长度在500～750 bp，符合ITS序列的长度范围。

3.2 不同样品ITS序列比较

对8个G. spinosa样品进行比较发现，除GSCA6的ITS序列不完整（575 bp）外，其余来自不同地区的7个G. spinosa 样品ITS区（包括ITS1、5.8S和ITS2序列）长度范围为 611～623 bp，长度变化12 bp。其中各样品ITS1区长度除GSNE1为223 bp外其他均為222 bp，长度变化不大。多数样品5.8S区的长度为164 bp，仅GSWA8出现了3个碱基的缺失。美国西部不同地区G. spinosa ITS2区的变化范围在225～237 bp之间，但GSCA6的ITS2区长度仅为189 bp。ITS序列的GC含量为60.35%～61.0%，ITS1与ITS2的GC量相近且较5.8S高（表 2）。ITS区全序列排列后长度为623 bp，共22个变异位点，5个简约信息位点，其中ITS1区含5个变异位点，位点79、103、113为简约信息位点，位点88为碱基G颠换为碱基T，且包含有一个简并碱基，位点111为碱基C转换为碱基T。 5.8S区含3个变异位点，无简约信息位点，其中位点223、248为碱基C转换为T，位点266为碱基G转换为碱基C。ITS2区有14个变异位点，其中除位点425、616为简约信息位点外，其余均为变异位点，其中位点563、590、601、614、615为碱基G-C之间的转换，位点613为碱基T颠换为碱基G，448为碱基C颠换为碱基T，位点600出现了碱基G-C间的转换以及碱基G-T间的颠换。位点542、622为碱基G-A间的颠换，位点617为碱基A颠换为碱基C，位点621为碱基C颠换为碱基A。表3结果表明，各样品间的长度变化主要出现在ITS2区。GC含量ITS2区较高，ITS1区次之，5.8S区较低。此外，简约信息位点ITS1区较ITS2区多一个，而就变异位点而言，ITS2区变异位点较ITS1区多，5.8S区除个别样品可能存在有变异位点外，其他位点均未出现变异。因此，ITS序列的主要变异也出现在ITS2区。G. spinosa的ITS序列碱基的主要变化是碱基的缺失，碱基的转换主要出现在G-C间，碱基的颠换主要出现在G-T间，而与分布区间并没有表现出相关联系。整个ITS区变异位点与简约信息位点分别占总位点的3.53%和0.80%。

3.3 样品间遗传距离分析

G.spinosa各样品间的遗传距离在0.0 018～0.008 9之间（表4），其中GSNE1与GSWA8、GSNE2与GSUT4、GSUT3与GSUT4、GSUT4与GSCA5、GSUT4与GSCA6间的遗传距离最小均为0.001 8。GSCO7与GSWA8 间的遗传距离最大，为0.008 9。外类群与G. spinosa各样品间的遗传距离均较G. spinosa各样品间的遗传距离大，在0.010 7～0.081 5之间。GSNE1与GBCO9间的遗传距离相对较小，为0.010 7，GSWA8与CFCA12间的遗传距離最大为0.081 5。对不同产地G. spinosa地理距离和遗传距离的Mantel检验表明，来自不同地区G. spinosa各样品间的遗传距离与地理距离的相关性不显著（R2=0.325，P=0.359）。

3.4 系统发育树分析

邻接法构建的系统发育树见图2，各分支的支持率均达到50以上。8个G. spinosa样品聚为一支，支持率为93，并与同属的GBCO9为姊妹群关系。其中，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7与GSNE2聚为一支，GSNE1与GSWA8聚为一支，但均分布于内华达地区的GSNE1与GSNE2却分属于这两支。由此可见，分布在同一地区的G. spinosa并未表现出更近的亲缘关系。

由于GSCA6未提交完整ITS2序列，且GSCO7与GSWA8（GSCO7和GSWA8的5.8S区出现了碱基的缺失与转换）可能存在假基因，因此我们仅以ITS1区序列重新构建了邻接树（图3）。结果与基于ITS全序列构建的邻接树的分支结构相同，不同仅表现在支持率较低、分支长度较短。

3.5 ITS序列RNA二级结构预测

利用在线软件RNAfold对美国西部不同分布区G. spinosa ITS的RNA二级结构进行了预测（图4）。ITS1区与ITS2区均含有封闭的环状结构，8个G. spinosa ITS序列的RNA二级结构依它们的相似状况大体上可以分为四类，分别记为type A，B，C和D。GSNE1、GSNE2与GSUT3三者的RNA二级结构的构象相似记为type A。

RNA二级结构构象相似的GSUT4和GSCA6记为type B，他们在5.8S区与ITS2区均出现了差异，且GSCA6的最小自由能更低，推测与GSCA6 ITS序列的缺失有关。GSCA5与GSWA8（type C）的构象相似，主要差异出现在ITS1区，由于GSWA8的最小自由能较GSCA5的高，因此推测GSCA5较GSWA8的RNA二级结构稳定。GSCO7（type D）在ITS1区出现了两个封闭的环，其RNA二级结构均不同于以上三类构象，在ITS1区出现了两个封闭的环。总体而言，G. spinosa ITS序列RNA 二级结构在ITS1，ITS2区以及5.8S区均出现了差异。虽然8个G. spinosa ITS样品彼此间RNA二级结构的相似性状况与一级结构的并不相同，但同样与其地理分布区间没有体现出一定的相关性。

4 讨论

ITS序列是近年来用于探讨植物近缘属间、种间系统关系和种内变异的重要分子标记。被子植物的ITS区长度比较稳定，包括5.8S rDNA在内，总长度为600～700 bp。该研究序列分析结果显示，8个G. spinosa ITS序列的长度仅GSNE1为623 bp，其余均为622 bp，符合被子植物ITS序列长度的变化范围。G. spinosa ITS1区序列长度保守，除GSNE1为223 bp外，其余均为222 bp，ITS序列长度的主要变化出现在ITS2区，多数样品5.8S区长度为164 bp，但是GSWA8为161 bp。Baldwin（1992）最早对被子植物ITS序列假基因的研究表明：被子植物5.8 S序列一般长度都在163～164 bp之间，若出现了插入或缺失就有可能形成假基因（人们把含有不具编码功能5.8S区ITS序列定义为ITS假基因）。G. spinosa ITS序列包括22个变异位点，说明ITS序列在G. spinosa系统发育关系分析中能够提供足够的证据。5.8S区最为保守，无简约信息位点，变异位点少。从ITS序列的变异位点来看，G. spinosa共有22个变异位点，这些变异位点主要存在于ITS2区，包含14个变异位点，占总变异位点数的63.63%，ITS1区仅有5个变异位点，5.8S区最为保守，含3个变异位点，无简约信息位点，因此仅以ITS1区构建系统发育树并不能提供足够信息量。屈良鹄和陈月琴（1999）通过对不同生物类群的ITS序列的比较得出：被子植物大多数科属ITS序列的种间差异值为1.2%～10.2%，曾明等（2003）和车建等（2007）在利用ITS序列分别对葛根和西红花正伪品的鉴定中均认为ITS序列种内差异值小于1%。该研究测得5个地区的8个G. spinosa样品在ITS区的碱基差异为3.53 %，表现出较大的遗传分化。同样，在对同一地区的G. spinosa样品系统发育分析中得出分布在内华达的GSNE1与GSNE2、犹他州的GSUT3与GSUT4以及分布在加利福利亚的GSCA5与GSCA6，相互间的遗传距离除GSUT3与GSUT4外，其余并非最小，采用邻接法构建的系统发育树，显示出同一地区的GSNE1与GSNE2也未聚在一起。这与地理距离与遗传距离Mantel检验的结果相吻合。

由于RNA二级结构比一级结构更具保守性，因此可以通过二级结构反映一级结构所反映不出的生物信息。该研究对8个G. spinosa样品的ITS序列RNA二级结构进行了比较，发现主要差异出现在ITS1区和ITS2区，这与ITS序列一级结构分析中其主要的变异位于ITS1区和ITS2区的结论相一致。

但是，有研究表明多数真核生物中ITS1区的RNA二级结构具有较高保守性（Musters et al，1990），并且3′端无论是在ITS序列一级结构还是其RNA二级结构中都比5′端更保守。而在我们的研究中对8个G. spinosa样品的ITS序列RNA二级结构的比较中发现仅GSUT4与GSCA6的ITS2区的RNA二级结构与其他6个样品较大的不同，较ITS1区RNA二级结构更为保守，这与ITS2区在进化中所受的选择压力较高有关。该研究对ITS序列一级结构与其RNA二级结构的分析还发现，在ITS序列一级结构系统发育分析中GSNE1与GSWA8体现出更近的亲缘关系，但是二者的RNA二級结构差异明显，分属于2个不同的类型中，同时GSNE2，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7在ITS序列一级结构分析中也体现了较近的亲缘关系，但是在它们的RNA二级结构分析中发现，GSNE2却与在一级结构分析中处在另一分支上的GSNE1的RNA二级结构基本一致，相似的情况也出现在GSWA8与GSCA5之间。研究发现突变位点若位于茎区，则有可能使二级结构改变，若突变发生在环上或自由基则对二级结构的影响不大，这可能与环状结构与维持RNA的功能有关。比较该研究中 8个G. spinosa样品ITS一级结构的突变位点仅ITS1区的位点88、103、111，ITS2区的位点621、622位于茎区，其余均位于环上，则对其二级结构的影响不大。总之，G. spinosa样品ITS一级结构与其RNA二级结构的变化并未表现出完美的一一对应关系，RNA二级结构体现出了更高的保守性。

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