红曲固态发酵产色素工艺条件的优化

童爱均 黄梓芮 洪家丽 吕旭聪 刘斌

摘 要：以果糖添加量、氯化铵和初始含水量为自变量，以红曲霉总色价为响应值，采用响应面优化法对红曲产色素的固态发酵条件进行了优化，结果表明：最优培养基条件为果糖添加量0.54%、氯化铵添加量0.06%和初始含水量46.00%，该设计中模型预测的色素最大值为6693.99 U·g-1。进行重复验证试验，经测定实际所得红曲色素为6684.16 U·g-1，与模型中预测的色素最大值相差不大，说明模型设计合理，吻合度较高。

关键词：红曲色素；固态发酵；培养基优化；响应面试验

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.05.008

Abstract： The solid fermentation conditions of red yeast for pigment production were optimized by using the response surface optimization method in which fructose additive amount， ammonium chloride amount and initial water contents as independent variables and total pigment value as response ones. The results showed that the optimal medium conditions were with 0.54% fructose， 0.06% ammonium chloride， and 46.00% initial water content. The predicted maximum pigment content in this design was 6693.99 U·g-1. Repeated verification tests were conducted， and the actual pigment production reached 6684.16 U·g-1， which was with little difference with the predicted maximum pigment output in the model， indicating that the model was well-designed with a high degree of coincidence.

Key words： Monascus pigment； solid fermentation； medium optimization； response surface test

紅曲，是红曲菌（Monascus）的发酵产品，在我国的福建、浙江、江西、广东、台湾一带广为使用[1]。红曲色素是红曲的次级代谢产物，是天然色素中稳定性最佳的色素[2-4]，作为一种药食两用的天然色素其应用前景非常广阔。近年来，由于亚硝酸盐的安全性问题红曲色素逐渐替代亚硝酸盐作为内制品着色剂[5-6]。

在固态发酵中，红曲色素受固体基质、外加碳源、外加氮源、无机盐、初始含水量等多种因素的影响，总色价普遍偏低，制约了红曲色素大规模规范化工业生产[7-9]。提高红曲色素产量包括菌种诱变、固定化细胞技术、菌种联合培养、超声波处理与优化培养基等多种途径[10]。如何优化固体发酵培养基、提升发酵水平、提高色素产量等技术问题，已经倍受国内外相关科研机构关注与研究[11-12]。本研究采用响应面分析法对实验室筛选培育的红曲色素高产菌株进行固体发酵的培养基优化，旨在提高红曲色素产量，为大规模规范化工业生产做好理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 红曲霉M3：由本试验室筛选保存。

1.1.2 主要仪器 UV2601型紫外可见分光光度计：北分瑞利公司有限公司；ME204E分析天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；LRH生化培养箱：上海一恒科学仪器公司；OKS24电热恒温水浴锅：上海精宏公司；VD850型洁净工作台：苏州净化设备公司等。

1.1.3 主要试剂 孢子洗脱液：含0.9% NaCl溶液；70%乙醇：70 mL乙醇用超纯水定容到100 mL；拌料液：用乳酸调得pH=5的超纯水；果糖、氯化铵、硫酸镁、磷酸二氢钾等均为国产试剂分析纯。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 斜面培养基 PDA培养基：称取300 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂各20 g，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000 mL，分装试管，加塞、包扎，（121℃）灭菌20 min后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

1.1.4.2 固体发酵培养基 红米20 g、KH2PO4 0.20%、MgSO4 0.30%与果糖（0.4%、0.6%、0.8%）、氯化铵（0.03%、0.07%、0.11%）分别装入250 mL三角瓶中，乳酸调得pH=5的超纯水（40%、50%、60%），浸泡12 h后包扎，121℃灭菌30 min，稍冷却后摇散，接种。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法 试管斜面培养：试管斜面接种后在30℃培养箱中培养7 d，至菌丝长满斜面。茄子瓶斜面培养：茄子瓶斜面接种后在30℃培养箱中培养7 d，至菌丝长满斜面。红曲色素固体发酵培养：接种5 mL于装有基质的250 mL三角瓶中，于30℃条件下避光培养10 d。

1.2.2 发酵物色价的测定 取发酵物约0.5 g，用70%乙醇10 mL浸泡振荡，超声波10 min过滤，取滤液适当稀释后在410、465、510 nm下测吸光度值分别为黄、橙、红色价。总色价=（OD410+OD465+OD510）×稀释倍数[13]。

1.2.3 培养基优化的响应面试验 根据Box-Benhnken 的原理，建立中心组合试验设计数学模型，采用Desin-Expert.8.05b版本中的Central Composite Design设计法以果糖添加量（A）、氯化铵添加量（B）和初始含水量（C）3个因子为自变量，红曲总色价产值（Y）为响应值，进行3因子3水平的试验设计。Central Composite Design试验设计因素与水平列于表1。用Desin-Expert.8.05b软件对响应面试验结果进行处理和方差分析，根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量（果糖添加量、氯化铵添加量和初始含水量）与响应值（色价）之间的多元二次回归方程。

2 结果与分析

2.1 模型方程的建立

响应变量（果糖添加量、 氯化铵添加量和初始含水量）与响应值（色价）之间的多元二次回归方程。

2.2 回归系数及显著性检验

根据表2的数据，对M3红曲霉总色价的回归模型进行方差分析，结果列于表3。该回归模型极显著（P<0.0001）。回归模型的相关系数R2=0.9943，校正系数R2Adj=0.9891，变异系数为7.43%，表明模型的拟合程度较好，试验误差小。失拟项P值为0.599 6，提示其影响不显著，即失拟项与纯误差之间差异不显著。该模型拟合较好，线性关系显著，可以用于后续的理论推测，可以对红曲固态发酵条件进行分析及预测。对回归方程系数进行显著性检验，果糖添加量A及其二次项A2，氯化铵添加量B及其二次项B2，初始含水量C及其二次项C2对总色价有着极显著（P<0.01）的影响；设计中果糖与其他2个因素之间交互作用不显著（P>0.05）3个因素对红曲固态发酵产色素能力的影响强度顺序依次为初始含水量>氯化铵添加量>果糖添加量。

2.3 双因子效应分析

双因子效应分析见图1a、图1b，图2a、图2b，图3a、图2b。对二次回归方程求解，可得出3个因素果糖添加量、氯化铵添加量和初始含水量的最佳水平，此时可得3个因素的真实值，A=0.54、B=0.06、C=46.00。即最优培养基条件：果糖添加量为0.54%、氯化铵添加量为0.06%和初始含水量46.00%，该设计中模型预测的色素最大值为6693.99 U·g-1。

为验证该模型，采用模型中的最佳发酵条件：果糖添加量为0.54%、氯化铵添加量0.06%、初始含水量46.00%、0.30% KH2PO4、0.20% MgSO4、初始pH 5.0、培养温度30℃

、装米量20 g、接种量5 mL。按照以上条件进行了5次重复红曲菌发酵培养试验，经测定实际所得红曲色素为6684.16 U·g-1，与模型中预测的色素最大值相差不大，说明模型设计合理，吻合度较高。

3 结论

利用模型的响应面对二次回归方程求解，可得出果糖添加量、氯化铵添加量和初始含水量的最佳水平，即最优培养基条件：果糖添加量3个因素0.54%、氯化铵添加量0.06%和初始含水量46.00%，该设计中模型预测的色素最大值为6693.99 U·g-1。果糖添加量为0.54%、氯化铵添加量0.06%、初始含水量3个因素46.00%、KH2PO40.30% 、MgSO40.20% 、初始pH 5.0、培养温度30℃、装米量20 g、接种量5 mL。按照以上条件进行了5次重复红曲菌发酵培养试验，经测定实际所得红曲色素为6684.16 U·g-1，与模型中预测的色素最大值相差不大，说明模型设计合理，吻合度较高。

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（责任编辑：柯文辉）