HBV母婴阻断失败儿童的HLA基因多态性研究

姚琳 佘芹 尹玉竹

【摘要】目的探討遗传因素对HBV母婴传播免疫阻断失败的影响。方法选择母亲血清HBsAg阳性、经联合免疫后发生HBV阻断失败的12例婴儿为研究对象，7月龄时抽取肘静脉血，提取DNA，对其进行HLADPB1、HLADPB2等2个基因中3个单核苷酸多态性（SNP）位点（rs2281388、rs9277535、rs9366816）的PCR扩增测序，分析目的SNP位点的碱基组成和等位基因比例，统计不同位点的基因频率，并与国际千人基因组计划中的中国南方人群比较。结果12例HBV母婴阻断失败婴儿的rs9277535位点GA基因型频率与中国南方人群比较差异有统计学意义（P<005），且GA基因型与AA基因型相比，新生儿感染HBV的风险较低（OR=0064，95% CI 0006～0641）；rs9366816的C等位基因频率与中国南方人群比较差异有统计学意义（P<005），且C等位基因与T等位基因相比，新生儿感染HBV的风险较高（OR=2585，95% CI 1008～6629）；HBV母婴阻断失败婴儿的rs2281388各基因型及等位基因频率与中国南方人群比较差异无统计学意义（P均>005）。结论rs9277535（HLADPB1）的GA基因型可能是HBV母婴传播的保护性因素，rs9366816（HLADPB2）的C等位基因可能是HBV母婴传播的危险性因素。

【关键词】乙型肝炎病毒；母婴传播；易感基因；单核苷酸多态性

Study of the polymorphism of HLA gene in the failure of blockage of mothertochild transmission of hepatitis B virus：a report of 12 casesYao Lin， She Qin， Yin Yuzhu Department of Obstetrics， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Yin Yuzhu， Email： yyzst2011@163com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of genetic factors on the failure of immune blockage of mothertochild transmission of hepatitis B virus （HBV） MethodsTwelve infants presenting with the failure of HBV transmission blockage after combined immunotherapy and positive serum HBsAg of their mothers were recruited in this investigation The venous blood samples were collected from the elbows of the 7monthold infants DNA extraction was performed Three single nucleotide polymorphisms （SNPs， rs2281388， rs9277535 and rs9366816） at the HLADPB1 and HLADPB2 loci were subject to PCR amplification sequencing The base composition and allele proportion of the target SNP sites were analyzed The gene frequencies at different loci were statistically compared with those in the southern Chinese population recorded in the 1000s Genomes Project ResultsThe frequencies of GA genotype of rs9277535 significantly differed between 12 infants with the failure of HBV transmission blockage and the population from southern China （P<005） The infants with GA genotype had a lower risk of HBV infection compared with their counterparts with AA genotype （OR=0064，95% CI： 00060641） The frequency of C allele of rs9366816 also significantly differed from that of the southern population （P<005） The infants with C allele had a higher risk of HBV infection compared with those with T allele （OR=2585， 95% CI： 10086629） However， there was no significant difference in the frequencies of rs2281388 genotypes and alleles between 12 infants and those from southern China （all P> 005） ConclusionThe GA genotype of rs9277535 （HLADPB1） may be a protective factor， whereas the C allele of rs9366816 （HLADPB2） is probably a risk factor of mothertochild transmission of HBV

【Key words】Hepatitis B virus； Mothertochild transmission； Susceptibility gene；

Single nucleotide polymorphisms

HBV母婴传播是导致人群携带HBV的主要原因。研究发现，孕妇血清HBeAg阳性和HBV DNA高水平是HBV母婴传播免疫阻断失败的危险因素[12]。然而，并非所有具有高危因素的孕妇所分娩的新生儿都发生免疫阻断失败。HBV母婴阻断失败除了与病原学特征、环境、遗传背景等因素有关外，还可能与宿主存在HBV感染的易感基因有关。有报道，与健康人群相比，慢性乙型肝炎（CHB）患者的HLA基因中存在与HBV在成年人之间水平传播相关的基因型[39]。本研究拟从寻找HBV感染相关易感基因着手，探讨遗传因素对HBV母婴传播免疫阻断失败的影响，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

选取2011年1月至2016年3月在中山大学附属第三医院产科出生、母亲血清HBsAg阳性、经联合免疫后发生免疫阻断失败的婴儿为研究对象。病例选择标准：①母亲年龄20岁或以上，孕28～42周，血清HBsAg阳性，本次妊娠为单胎，无严重肝、肾功能异常及其他严重妊娠合并症，血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系列检查均阴性，妊娠期间未使用抗病毒药物、免疫调节药和细胞毒性药，无长期使用肾上腺皮质激素类药物史，配偶HBsAg阴性；②婴儿发生免疫阻断失败，但无严重的内外科疾病和先天畸形。本研究经中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，所有研究对象的监护人均已签署知情同意书。

二、诊断标准

免疫阻断失败是指新生儿出生时HBsAg和（或）HBV DNA阳性并持续阳性至7月龄。HBV DNA阳性指血液中的HBV数量超过了HBVDNA正常值（100 IU/ml）。

三、免疫接种方案

新生儿于出生24 h内尽早肌内注射乙肝Ig 100 U，并按0、1、6方案接种重组酵母乙肝疫苗10 μg进行主被动联合免疫。分别于出生时联合免疫前以及7月龄时采集婴儿肘静脉血，进行HBV血清标志物（HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc）的检测。

四、检测方法

国际千人基因组计划（https： //www ncbi nlm nih gov/variation/tools/1000genomes/），是由中英美德等国科学家共同承担研究任务，绘制了迄今为止最详尽的、最有医学应用价值的人类基因组遗传多态性图谱，其测序人群包含了以广东人群为主的中国南方人群。采用DNAMAN软件对比DNA序列评估测序结果，Chromas软件分析测序峰图，统计目的SNP位点的碱基组成和等位基因比例，计算不同位点的杂合率，并与国际千人基因组计划中的中国南方人群比较。

五、统计学处理

采用SPSS 220处理数据。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用二分类Logistic回归模型分析各基因型与儿童感染HBV的关系，计算优势比（OR）和95%可信区间（CI）。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、12例免疫阻断失败儿童的一般资料

2011年1月至2016年3月符合纳入标准的免疫阻断失败儿童共12例，其一般资料见表2。

讨论

中国是HBV感染的高发地区，育龄女性中HBV感染率高达718%，从而使HBV母婴传播的风险增加[1013]。对HBsAg阳性孕妇所分娩的新生儿进行乙肝Ig和乙肝疫苗的联合免疫，可阻断大部分母婴传播，但仍有婴儿发生免疫阻断失败，成为新的HBV感染者。有研究表明，HBV母婴阻断失败可能和病毒因素、妊娠期阻断方式有关，但与宿主遗传因素的关系仍知之甚少[12，1416]。自20世纪70年代初以来，HLA被证实为最主要的与感染性疾病易感性相关基因，并作为个体组织细胞的遗传学标志，在抗原识别、免疫应答等方面起着重要的作用。其通过影响抗原提呈等免疫应答过程，对宿主清除外来病毒如HBV病毒发挥作用，并可能影响病毒感染的持久化以及感染后病情进展。

2009年，日本全基因组研究中心首次提出HLADPB1的rs9277535与日本成年人CHB有关[34]。针对中国人群的研究也表明rs9277535与CHB有关，提出HLADP的基因多态性在成年人HBV感染中扮演重要的角色，该研究还证实了rs9277535的A等位基因与HBV的清除有关，能降低中国汉族人罹患CHB的风险[57]。另有研究发现，HLADPB2 的rs9366816与HBV的持续性感染有关[8]。2016年Fan等[9]的研究表明，HLADP基因上的rs9277535 GG基因型、rs9366816 TC基因型和rs2281388 GA基因型与成年人HBV持续性感染相关，并进一步发现rs9277535的GA基因型与HBV母婴阻断失败后感染有关。

本研究对12例免疫阻断失败儿童外周血中的3个相关SNP位点进行了PCR扩增测序和分析，并与中国南方人群的基因频率相比，结果显示rs9277535（HLADPB1）和rs9366816（HLADPB2）的基因型或等位基因频率与中国南方人群比较差异有统计学意义，提示这2个位点可能与免疫阻断失败有关。其中免疫阻断失败儿童的rs9277535的GA基因型频率为8%，远低于中国南方人群的47%，和Fan等[9]的研究结论一致。他们的研究认为， rs9277535的GA基因型与儿童免疫阻断失败后感染有关。本研究提示，HLADPB1基因上rs9277535的GA基因型可能是HBV感染的保护性基因型，具有此基因型者，可能会降低HBV的母婴感染率。既往研究證实，HLADPB2基因rs9366816的CT基因型与成年人的HBV持续性感染有关[89]。本研究中，12例免疫阻断失败儿童的rs9366816 CT基因型频率（33%）与中国南方人群（49%）相近。但免疫阻断失败儿童rs9366816的C等位基因频率为67%，高于中国南方人群的基因频率（43%），提示rs9366816的C等位基因可能是HBV感染的易感基因，不仅能导致成年人的持续性HBV感染，还可能会增加HBV母婴阻断失败的风险。既往研究发现，rs2281388 CT基因型与成年人慢性HBV感染有关[9]。在本研究免疫阻断失败儿童中的rs2281388 CT基因型频率为50%，与中国南方人群的基因型频率（47%）相近，可能与本研究的样本量较小有关；也可能提示由于儿童的免疫系统与成人相比尚未完全发育，从而存在不同的免疫机制有关，其与儿童HBV母婴传播免疫阻断失败无关。

胎兒由于免疫系统的特殊性，其基因组中是否含有围生期感染HBV的易感基因型尚不明确。本研究中，虽然在免疫阻断失败儿童中发现了2个SNP位点与南方人群中的基因型频率存在差异，但由于病例数较少，尚不能说明其与HBV感染相关，需要在后续的研究中，进一步扩大样本量和增加目的SNP位点，继续探讨遗传因素对HBV母婴阻断失败的影响，进而为在人群中筛选具有遗传易感性的高危个体，并对其采取针对性的预防措施或治疗手段，为减少HBV的母婴传播和控制慢性 HBV感染提供理论与实验指导。

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（收稿日期：20180226）

（本文编辑：林燕薇）