铜绿微囊藻对WSSV潜伏感染对虾的致死效应

曹煜成 徐煜 黄小帅 胡晓娟 李卓佳 李凡 陈勇贵 文国樑

摘要：【目的】明确池塘优势蓝藻对潜伏感染白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的致死效应，为完善养殖对虾病害生态防控技术提供理论依据。【方法】分别设阳性对照组（PC）、阴性对照组（NC）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）活藻组（MAL）和铜绿微囊藻死藻组（MAD），加藻组的铜绿微囊藻初始密度均为106 cells/mL，每组各设3个平行，试验周期144 h。除NC组对虾不携带WSSV外，其他组的对虾均经WSSV人工注射感染。采用实时荧光定量PCR-TaqMan探針检测对虾样品中的WSSV携带状况，并通过显微计数法统计铜绿微囊藻细胞数量。【结果】NC组对虾在试验结束时（144 h）的累计死亡率为11.1%；PC、MAL和MAD组的对虾累计死亡率随时间推移呈明显升高趋势，至试验结束时的累计死亡率分别为64.4%、82.2%和88.9%，表现为加铜绿微囊藻（MAL和MAD）组的对虾累计死亡率远高于2个对照组（PC和NC）。MAL、MAD和PC组对虾肌肉样品均携带104 copies/g以上的WSSV，其中又以MAD组的WSSV携带量最高。在铜绿微囊藻试验组中，对虾死亡率与铜绿微囊藻呈显著相关（P<0.05），与WSSV的相关性则未达显著水平（P>0.05）。【结论】铜绿微囊藻能有效加速WSSV感染对虾的死亡速率，增加对虾累计死亡率，即使是死亡的微囊藻细胞也能促进对虾体内WSSV的增殖。

关键词： 凡纳滨对虾；铜绿微囊藻；白斑综合征病毒（WSSV）；累计死亡率；致死效应

中图分类号： S945.49 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1648-06

0 引言

【研究意义】虾池水体在养殖中后期富营养化水平普遍升高，此时微囊藻等有害蓝藻极易形成优势群落。优势蓝藻不仅主导水体微藻群落的动态变化，影响池塘水环境生态结构（刘孝竹等，2009；彭聪聪等，2011），还分泌蓝藻毒素（戴瑾瑾等，2009；Catherine et al.，2013；Chen et al.，2016），严重危害养殖生物的生长发育（Cao et al.，2014）。此外，养殖水体中有害蓝藻的数量和相对丰度与对虾存活率密切相关（查广才等，2007；文国樑等，2015；Gao et al.，2017），且影响对虾的免疫水平，增加其感染发病的风险（乐亚玲等，2011）。因此，研究有害蓝藻对养殖对虾体内病原体增殖响应的影响，对进一步明晰水体微藻藻相环境在对虾病害发生过程中的贡献具有重要意义。【前人研究进展】白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是近年来严重制约对虾养殖产业发展的重要病原之一（Flegel，2012）。至今，已有大量学者从WSSV的生物学结构、病症暴发与主要环境因子相关性及WSSV感染对虾的免疫生理反应等方面进行系统研究（Yang et al.，2001；Lotz and Soto，2002；李奕雯等，2008；Huang et al.，2010；Qiu et al.，2014；Yuan et al.，2017），为明晰WSSV在养殖对虾中的传播模式与途径（何建国和莫福，1999；Lotz and Soto，2002），明确对虾机体中NF-κB和ER等免疫系统对WSSV感染的响应机制（Yang et al.，2001；Huang et al.，2010；Qiu et al.，2014），以及了解水体环境因子与对虾白斑综合征暴发的关系（何建国和莫福，1999；李奕雯等，2008）提供了理论依据，对下一步建立对虾白斑综合征生态防控技术体系具有重要意义。在有害蓝藻对WSSV潜伏感染对虾的致死性分析方面，王奕玲等（2012）指出在集约化对虾养殖生产过程中，当遭遇异常天气时水体微藻群落会产生剧烈变动，形成以蓝藻为优势的藻相结构，同时虾体中WSSV携带量急剧升高，造成对虾大量发病死亡；徐煜等（2017）研究发现蓝藻细胞可导致对虾急性中毒死亡，且其致死效应与藻细胞密度和水温均呈明显正相关；Gao等（2017）研究表明，在蓝藻环境中对虾机体NF-κB、JAK/STAT和P38 MAPK等免疫信号通路中的许多抗菌肽基因表达受到抑制。【本研究切入点】前人研究主要是基于自然养殖水体环境下对虾对蓝藻环境的综合反应状态，但实际生产中还可能受温度、盐度、养殖水体土著微生物群落结构及养殖生产操作措施等背景的影响。目前，有关虾体WSSV携带量对水环境有害蓝藻的响应及WSSV与有害蓝藻协同作用时二者对对虾致死效应的影响尚不明确。【拟解决的关键问题】选择虾池优势有害蓝藻——铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）为材料，将潜伏感染WSSV的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）分别置于其活藻和死藻环境中，对比分析对虾死亡率及WSSV的动态变化，旨在明确有害蓝藻对WSSV感染对虾的影响，为完善养殖对虾病害生态防控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

铜绿微囊藻由中国水产科学研究院南海水产研究所提供，分离自对虾集约化养殖池塘水体。铜绿微囊藻以BG11液体培养基进行扩大培养，达到指数生长期后用于试验。供试对虾为取自中山大学珠海海洋生物技术研究开发中心高位池的健康凡纳滨对虾，试验前于室内水族试验系统暂养1周，期间以充气方式保证水体溶解氧，水体为沙滤消毒海水[盐度（10±2）‰]，水温维持在26 ℃左右，每天投喂2次人工配合饵料并定时排污换水，以保持良好水质环境。对虾体长5.8±0.2 cm、体重2.4±0.2 g/尾，经PCR检测呈WSSV阴性。WSSV由中山大学海洋学院提供，经检测虾体肌肉中WSSV携带量为1010 copies/g。

1. 2 WSSV粗提液制备及人工感染

准确称取对虾肌肉组织0.5 g，加入4.0 mL PBS于4 ℃下进行研磨，匀浆液6300×g离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌，即获得WSSV粗提液。选取活力正常、大小均一的对虾，使用1.0 mL无菌注射器在对虾第3腹节基膜处通过肌肉注射WSSV粗提液50.0 μL/尾（6.25×107 copies），然后放入充氧的试验水体中暂养24 h，选取活力正常且WSSV呈阳性的对虾用于后续试验。

1. 3 铜绿微囊藻对健康对虾的影响

分别设阴性对照组（NC）、铜绿微囊藻活藻组（L）和铜绿微囊藻死藻组（D），每组设3个平行（水族箱）。其中，L组中加入活体微囊藻细胞；D组中加入经高温灭活（100 ℃灭活6～10 min）的铜绿微囊藻藻液，铜绿微囊藻初始密度为106 cells/mL。试验采用室内养殖生态实验系统，每个水族箱的水体容积15 L，分别放入相应的供试对虾15尾，以充气增氧方式保证水体溶解氧。每天早、晚各投喂1次人工配合饵料，饱食20 min后以虹吸管吸出残饵。试验周期144 h，期间水族箱区域的光强为400～8000 lx，可为水中活体藻细胞的生长提供光源；同时确保水温维持在24 ℃左右，pH 8.0～8.5，溶解氧5.9～8.4 mg/L，以满足对虾健康生长的需求。

1. 4 铜绿微囊藻对WSSV携带对虾的影响

分别设阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）、铜绿微囊藻活藻组（MAL）和铜绿微囊藻死藻组（MAD）。其中，NC组对虾不携带WSSV（注射等量无菌PBS），PC组对虾为攻毒后活力正常的凡纳滨对虾，2个对照组水体中均不添加铜绿微囊藻；MAL组中加入活体微囊藻细胞，MAD组中加入经高温灭活（100 ℃灭活6～10 min）的铜绿微囊藻藻液，对应的铜绿微囊藻初始密度均为106 cells/mL，对虾则为WSSV潜伏感染但活力正常的凡纳滨对虾。其他饲养管理同1.3。

1. 5 铜绿微囊藻细胞检测

分别于第48、96和144 h采集MAL组水样10.0 mL，采用福尔马林液固定，在显微镜（OLYMPUS CX41，日本）下以血球计数板准确计数铜绿微囊藻细胞数量。

1. 6 WSSV检测

试验过程中每隔2 h观察对虾存活情况并记录对虾死亡数量及死亡时间，将新鲜死亡对虾置于-80 ℃冰箱保存。分别取试验中期（72～96 h）、后期（120～144 h）的对虾样品进行WSSV检测，每份待测组织取样0.044±0.012 g，共取3个平行，然后以实时荧光定量PCR-TaqMan探针检测样品中的WSSV携带状况。具体步骤：依照OMEGA Tissue DNA Kit D3396试剂盒说明提取对虾肌肉组织DNA，参照李凡等（2014）的方法制备WSSV阳性质粒标准品和绘制标准曲线，并采用Durand和Lightener（2002）的PCR-TaqMan探针法检测WSSV。所用引物（WSS1011F：5'-TGGTCCCGTCCTCATCTCAG-3'；WSS1079

R：5'-GCTGCCTTGCCGGAAATTA-3'）和TaqMan探针（5'-AGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACA-3'）均由Invitrogen公司合成。PCR反应体系20.0 μL：DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL（终浓度10 μmol/L），TaqMan探针0.5 μL（终浓度5 μmol/L），2×TaqMan Universal PCR Master Mix（TaKaRa）10.0 μL，以双蒸水补足至20.0 μL。检测时设空白对照和阳性对照，前者以无菌超纯水为模板，后者以WSSV阳性对虾的DNA片段为模板。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环。每组设4个平行。

1. 7 统计分析

采用相关性分析方法评估对虾死亡率与WSSV和蓝藻间的相互关系，并以单因素方差分析检验各处理组间的差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 铜绿微囊藻对健康对虾的毒性作用

铜绿微囊藻对健康对虾的毒性作用主要表现为诱导死亡。由图1可知，NC组对虾累计死亡率始终保持在较低水平，至试验结束时（144 h）仅为11.1%；L组和D组的对虾累计死亡率随时间推移呈逐渐升高趋势，尤其是24 h后对虾累计死亡率明显升高。在120 h之前，D组的对虾累计死亡率一直高于L组；至120 h时两组的对虾累计死亡率一致，为63.3%；此后，L组的对虾累计死亡率略高于D组，至试验结束时对应的对虾累计死亡率分别为80.0%和76.7%。

2. 2 铜绿微囊藻对WSSV携带对虾的毒害作用及其自身数量的变化

觀察发现，初始时各组对虾的游泳和摄食能力均表现正常，肝胰腺为褐色，消化道呈褐色粗线条状；72 h后除NC组外，其他各组对虾陆续出现摄食量大幅减少、游泳能力严重下降及反应迟缓等症状。由图2可看出，NC组对虾在试验结束时（144 h）的累计死亡率为11.1%；PC、MAL和MAD组的对虾累计死亡率均随时间推移呈明显升高趋势，在72～144 h的死亡率升高趋势尤为明显，至试验结束时的累计死亡率分别为64.4%、82.2%和88.9%，表现为加入铜绿微囊藻（MAL和MAD）组的对虾累计死亡率远高于2个对照组（PC和NC）。整个试验期间，MAL组铜绿微囊藻细胞略有增长，至试验结束时为4.3×106 cells/mL（图3）；MAD组水体中存在大量铜绿微囊藻细胞碎片但未见细胞活体；NC和PC组水体中无铜绿微囊藻细胞存在。可见，铜绿微囊藻等有毒蓝藻能加速WSSV潜伏感染对虾的死亡，且无论藻体细胞存活与否均可对对虾产生严重的毒害效应。

2. 3 对虾WSSV的检测结果

采用实时荧光定量PCR-TaqMan探针检测中、后期对虾肌肉的WSSV携带量，以质粒拷贝数为横坐标、循环阈值为纵坐标绘制标准线（图4），获得曲线方程为：y=-3.317x+39.647，拟合度系数（R2）为0.9997。检测结果表明，MAL、MAD和PC组对虾肌肉样品均携带104 copies/g以上的WSSV，其中又以MAD组的WSSV携带量最高（图5），中期（72～96 h）和后期（120～144 h）的WSSV携带量分别为1.01×109和7.06×105 copies/g；MAL和PC组样品则维持在3.12×104～4.22×104 copies/g；而NC组样品在试验过程中未测出WSSV。

2. 4 对虾死亡率与WSSV和铜绿微囊藻间的相关性分析结果

如表1所示，在铜绿微囊藻试验组中，对虾死亡率与铜绿微囊藻呈显著相关（P<0.05），与WSSV的相关性则未达显著水平（P>0.05），且前者的相关系数（0.525）远大于后者。进一步验证，当对虾体内潜伏感染WSSV时，不论水体中的铜绿微囊藻细胞处于活体状态还是死亡细胞，均能加速对虾的死亡。

3 讨论

在对虾养殖过程中，即使虾体携带WSSV，若池塘水体环境条件良好可使其始终处于潜伏感染状态，直至养殖收获（孙成波等，2009；王奕玲等，2012）。因此，在一定程度上WSSV的感染并非必然导致养殖对虾大批量死亡的唯一因子。微囊藻是对虾养殖池塘中常见的有害蓝藻优势种，尤其当水体盐度小于10‰时微囊藻的优势度相对较高（查广才等，2007；刘孝竹等，2009）。微囊藻能分泌微囊藻毒素（Svrcek and Smith，2004），其主要作用的靶器官是肝脏，但也有学者认为在养殖对虾肌肉中能检测出微囊藻毒素（Chen and Xie，2005）。曹平等（2011）研究表明，蓝藻可严重影响对虾的存活与生长；徐煜等（2017）将蓝藻细胞破碎处理后对养殖对虾进行肌肉注射，结果发现当蓝藻细胞密度为5.0×107 cell/mL时对虾死亡率高达86.7%。本研究将潜伏感染WSSV的对虾置于不同铜绿微囊藻环境中，结果发现无论是活藻细胞组还是死藻细胞组的对虾累计死亡率均远高于WSSV阳性对照组和阴性对照组；对虾死亡率与WSSV和铜绿微囊藻间的相关性分析结果也显示，当对虾体内潜伏感染WSSV时，不论水体中的铜绿微囊藻细胞是处于活体状态还是死亡细胞，均对对虾具有明显的致死效应。但从对虾肌肉携带WSSV的状况来看，仅铜绿微囊藻死藻组的虾样WSSV携带量呈明显上升趋势，而活藻组和阳性对照组均维持在104 copies/g水平。可见，有害蓝藻可能并非仅通过诱发虾体中的WSSV大量增殖而导致对虾大批量死亡，但具体原因有待进一步探究。

综合分析，有害蓝藻对WSSV潜伏感染对虾的致死效应可能有以下3种原因。其一，在蓝藻毒素的作用下对虾抗病力急剧下降，其健康水平受到严重胁迫。曹平等（2011）研究报道，当水体中颤藻数量维持在较高水平时虾体内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、酚氧化酶（PO）和抗菌活力均呈下降趋势。Gao等（2017）研究指出，在蓝藻环境中对虾机体的NF-κB、JAK/STAT和P38 MAPK等免疫信号通路中的许多抗菌肽基因表达受到抑制，且溶菌酶基因表达量和血淋巴细胞数量呈不同程度的下降趋势，而吞噬细胞活性明显上升。说明有害蓝藻对对虾机体抗病系统的影响是一个综合性的负面效应，其结果是全面损害对虾的健康维持系统，从而诱发死亡连锁反应。因此，即使对虾体内的WSSV未出现大量增殖，直接通过蓝藻自身的毒害效应也能促使对虾发病死亡。其二，当对虾感染WSSV时其体内相关组织器官或免疫系统均受到不同程度的损害，致使对虾机体的抗逆或抗病能力处于较低水平，从而极易诱发死亡。WSSV可侵染对虾的鳃、消化道、肌肉、上皮组织和造血组织等，侵染组织器官发生不同程度的病变，致使相关细胞的胞质结构溃散、线粒体肿胀或碎裂、内质网扩张、核糖体脱落、溶酶体空泡化和胞核破裂（郑天伦和王国良，2002；戴俊逸，2012）；同时，对虾体的抗菌活力（Ua）、溶菌活力（UL）、PO、POD、碱性磷酸酶（ALP）及凝血效价（HAT）等免疫指标均受到不良影响（雷质文等，2001）。可见，即使对虾体内WSSV未出现大量增殖，也有可能在病毒的诱发连锁反应下虾体健康维持系统已受到严重侵害，从而促使WSSV感染对虾发生死亡。其三，WSSV严重损害对虾的抗逆和抗病机能，此时加之环境中微囊藻等有害蓝藻的毒害作用，使得对虾在WSSV和有害蓝藻的双重胁迫效应下发生大批量死亡。本研究中，铜绿微囊藻活藻组和铜绿微囊藻死藻组的对虾累计死亡率均远高于阳性对照组，可能就是WSSV和铜绿微囊藻活藻的叠加胁迫效应所致。

总之，在对虾养殖过程中需严格压制微囊藻等有害蓝藻的生态优势，调控优化池塘水体生态环境，即使对虾携带一定量的WSSV也可极大降低对虾病害暴发的风险（Tendencia et al.，2012），而獲得良好的养殖收益。因此，有必要将水体微藻群落结构的调控优化作为对虾白斑综合症生态防控的重要措施之一。

4 结论

铜绿微囊藻能有效加速WSSV感染对虾的死亡速率，增加对虾累计死亡率，即使是死亡的微囊藻细胞也能促进对虾体内WSSV的增殖。

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（責任编辑 兰宗宝）