丹参片治疗口腔黏膜白斑及对局部组织金属基质蛋白酶—2、基质金属蛋白酶—9表达的影响

朱鹏君　邹桂梅　汪铭

摘要 目的：探讨丹参片治疗口腔黏膜白斑（OLK）的临床疗效及对局部组织细胞金属基质蛋白酶-2、9（MMP-2、MMP-9）表达的影响。方法：选取2014年5月至2016年3月南京中医药大学附属南京市中西医结合医院OLK患者136例，随机分为对照组与观察组，每组68例，同期进行口腔检查的20例健康人群作为健康对照组。对照组患者给予维甲酸和西瓜霜喷雾剂治疗，观察组则在对照组的基础上联合丹参片治疗。2个月为1个疗程，2组均连续治疗1个疗程，治疗后随访12个月。比较2组治疗后临床疗效，采用免疫组化法检测OLK患者及健康对照组局部黏膜组织中MMP-2、MMP-9表達情况。结果：治疗2个月后观察组总有效率为80.88%，显著高于对照组的63.24%（P<0.05）；治疗4个月后观察组总有效率较治疗2个月后明显升高，且高于对照组（P<0.05）。与健康对照组比较，观察组局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显升高（P<0.05）；与治疗前比较，治疗2个月及4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显降低（P<0.05），且治疗4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率低于对照组（P<0.05）；对照组仅治疗4个月后局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率较治疗前降低（P<0.05）。2组随访期间观察组复发率明显低于对照组（P<0.05），2组癌变率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：丹参片联合常规药物治疗OLK效果显著，可显著抑制局部组织MMP-2和MMP-9表达，并在短期内对抑制组织癌变具有一定的积极作用。

关键词 口腔黏膜白斑；丹参片；金属基质蛋白酶

Abstract Objective：To explore the clinical efficacy of Danshen Tablet on oral leukoplakia （OLK） and its effects on the expression of metal matrix protease-2，9 （MMP-2 and MMP-9） in local tissues.Methods：A total of 136 patients with OLK treated in Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine from May 2014 to March 2016 were selected and randomly divided into control group and observation group，with 68 cases in each group，and 20 cases of healthy people were chosen in the same period as healthy control group.The patients in the control group were treated with retinoic acid and watermelon frost spray，and the observation group was treated with Danshen Tablet on the basis of the same treatment.Both groups were treated for 1 course （2 months as a course） and followed up for 12 months after treatment.The clinical effects of the 2 groups were compared and the expressions of MMP-2 and MMP-9 in local mucosa of OLK patients and healthy controls were detected by immunohistochemistry.Results：After 2 months treatment，the total effective rate of the observation group was 80.88%，which was significantly higher than 63.24% of the control group （P<0.05）.After 4 months′ treatment，compared with 2 months treatment，the total effective rate in the observation group was significantly increased which was higher than the control group （P<0.05）.Compared with the healthy control group，the positive expression rates of MMP-2 and MMP-9 in the local mucosa tissues of OLK patients were significantly increased （P<0.01），and the positive expression rates of MMP-2 and MMP-9 in the local mucosa tissues in the observation group decreased more significantly after 2 months and 4 months treatment than before treatment （P<0.05 or P<0.01）.The positive expression rate of MMP-2 in the local mucosa tissues of observation group was decreased more than control group （P<0.05），and the positive expression rate of MMP-2 in local mucosa tissues of the control group 4 months after treatment decreased more significantly than that before treatment （P<0.05）.The recurrence rate of the observation group decreased more significantly than that of the control group during the follow-up period （P<0.05），and there was no significant difference in cancer rate between the 2 groups （P>0.05）.Conclusion：The combination of Danshen Tablets and conventional drugs have significant effects on OLK.It can significantly inhibit the expression of MMP-2 and MMP-9 in local tissues，which has a positive effect on the inhibition of tissue cancer in the short term.

Key Words Oral leukoplakia； Danshen Tablets； Metal matrix protease

中图分类号：R289.5；R751文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.020

口腔黏膜白斑病（OLK）发病机制复杂，与内分泌功能紊乱、维生素缺乏、霉菌感染及局部持续性机械刺激等导致口腔黏膜上皮过度角化等有关，患者可于颊、舌、唇等部位黏膜上出现灰白色或乳白色斑状病变，随着疾病进展病变部位可逐渐增大、变厚及变粗糙。口服维生素、冷冻及手术治疗可改善OLK患者临床症状。但有研究显示，OLK癌变率为3%～5%，单纯对症治疗无法有效控制其癌前病变[1]。研究显示，丹参主要有效成分丹参酮可抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞及结直肠癌细胞等的体外增殖，具有明显的抑制肿瘤细胞凋亡的作用[2-4]。细胞金属基质蛋白酶（MMP）是由肿瘤细胞分泌的一类具有降解细胞外基质及基底膜的蛋白水解酶，在肿瘤侵袭及迁移过程中具有非常重要的生物学作用[5]。本研究重点探讨丹参片对OLK的治疗效果及对局部组织MMP-2、MMP-9表达的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年5月至2016年3月本院收治的OLK患者136例，随机分为对照组和观察组，每组68例。对照组中男47例，女21例；平均年龄（45.5±8.6）岁；平均病程（5.7±3.1）个月；其中均质型42例，颗粒型14例，其他类型12例。观察组中男43例，女25例；平均年龄（47.7±9.1）岁；平均病程（5.5±3.9）个月；其中均质型44例，颗粒型12例，其他类型12例。同时选取20名同期进行口腔检查的健康人作为健康对照组，男13名，女7名；平均年龄（47.5±8.4）岁。3组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准 所有患者均经临床体征检查及病理组织学检查确诊，符合WHO口腔黏膜癌前病变协作中心对白斑的诊断。中医诊断参照国家中医药管理局颁布的《中医临床诊疗规范》和《中医病证诊断疗效标准》。

1.3 纳入标准 符合上述诊断标准者；治疗依从性良好者；所有入组患者及其家属对研究内容及意义均知情同意者。

1.4 排除标准 白斑区出现基底变硬、表面增厚及溃疡等疑似癌变者；伴有其他严重心内科疾病者；伴有恶性肿瘤者；伴有明显精神异常者；对本研究所用药物存在过敏现象者；妊娠或哺乳期妇女等。

1.5 脱落与剔除标准 治疗期间因发生严重不良事件需终止治疗者；治疗期间擅自增減治疗药物者；未能按照治疗方案完成治疗周期者；主动提出退出本研究者等。

1.6 治疗方法 2组患者入院后常规去除口腔内不良修复体，清洁口腔，并嘱其生活中注意戒烟戒酒，饮食清淡等，对照组患者口服维甲酸，10 mg/次，1次/d；西瓜霜喷雾剂，1～2 g/次，8～10次/d；观察组则在对照组的基础上联合丹参片治疗，3片/次，3次/d。2个月为1个疗程，2组均连续治疗1个疗程。

1.7 观察指标 1）统计2组患者临床疗效；2）分别于治疗前及治疗2个月、4个月后采集2组患者口腔黏膜白斑组织，同时采集健康对照组正常左侧口腔黏膜，口腔黏膜白斑组织石蜡包埋后制成切片，经二甲苯脱蜡，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶后，采用免疫组化法检测口腔黏膜白斑组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达情况：石蜡切片复温，分别滴加一抗：兔抗人多克隆抗体MMP-2、MMP-9（北京中杉金桥公司，工作浓度1∶100），37 ℃下孵育30 min，经磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤，3 min/次，洗3次；滴加二抗：广谱通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min，经PBS洗涤，3 min/次，洗3次；滴加DAB染色液，显微镜下控制显色；经苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，自然晾干后，以中性树胶封片，于光学显微镜下判定染色结果，阳性着色为细胞膜或细胞质棕黄及棕褐色；随机选取5个视野，统计各个视野中阳性细胞百分比，然后对各个视野中的阳性细胞数评分，0分：阳性细胞百分比约为5%，阴性；1分：阳性细胞百分比为5%～25%，散发；2分：阳性细胞百分比为26%～50%，局部；3分：阳性细胞百分比为51%～75%，弥漫；4分：阳性细胞百分比>75%。阳性染色强度评分标准为：0分：不着色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。染色总评分=阳性细胞数评分×阳性染色强度评分。若染色总评分<3分，则为表达阴性；若染色总评分≥3分，则为表达阳性。3）治疗结束后所有患者均进行连续12个月的随访，统计并比较患者复发情况及癌变情况。

1.8 疗效判定标准 痊愈：临床症状消失，口腔黏膜白斑完全消退；显效：临床症状显著改善，口腔黏膜白斑面积减少超过2/3；有效：临床症状部分改善，口腔黏膜白斑面积减少在1/3～2/3；无效：临床症状未见改善，口腔黏膜白斑面积减少未超过1/3或无明显变化。总有效率=治愈率+显效率+有效率。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床疗效比较 治疗2个月后观察组总有效率为80.88%，显著高于对照组的63.24%（P<0.05）；治疗4个月后观察组总有效率较治疗2个月后明显升高，且高于对照组（P<0.05）。见表1。

2.2 2组MMP-2和MMP-9表达比较 与健康对照组比较，观察组局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显升高（P<0.05）；与治疗前比较，治疗2、4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显降低（P<0.05），且治疗4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率低于对照组；对照组仅治疗4个月后局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率较治疗前降低（P<0.05）。见表2。

免疫组化染色结果显示，MMP-2、MMP-9阳性着色主要为棕黄色染色，染色部位主要位于细胞质。如图1。

2.3 2组治疗12个月后复发及癌变情况比较

136例OLK患者中共有124例参与随访（观察组60例，对照组64例），随访期间失联8例（观察组3例，对照组5例），因其他非肿瘤疾病死亡4例（观察组和对照组各2例）；剩余112例患者中，观察组复发1例（1.82%），癌变为口腔颊癌1例（1.82%），对照组复发7例（12.28%），癌变为口腔颊癌3例（5.26%），观察组复发率明显低于对照组（P<0.05），2组癌变率差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

口腔黏膜白斑病（OLK）为口腔黏膜的角化性疾病，患者口腔黏膜局部可出现反复溃疡及疼痛，病程长，该病的发生及进展与患者长期多种刺激性因素综合作用有关，因此降低外界因素的刺激及注重内环境的调节对疾病治疗尤为重要。研究表明，OLK是口腔癌前病变的一种，部分中老年患者因机体新陈代谢及免疫功能的降低，可增加OLK癌变率[6-7]。临床数据显示，34%的OLK与白色念珠菌有关，OLK易使细胞产生恶性增殖及癌变[8]。

中医认为OLK是一种全身性疾病的局部表现，五脏六腑为其发病根源，尤与心脾密切相关，两颊属脾，舌为心之苗，其病因多由心火脾热、瘀血阻络、湿从热化薰蒸于口、舌而成，心移热于小肠则口、舌生疮，脾经湿热壅滞，浊气不降反升，浸润唇、舌、腭部、颊部黏膜则溃烂，与正气亏虚，热、毒、湿邪入侵有关[9-10]。胡莲[11]运用加味连术汤联合西药治疗OLK临床疗效达87.87%，明显高于單纯西药治疗。董文杰等[12]在局部或全身药物治疗外，应用清热健脾、理气排毒中药汤剂治疗也取得了较为满意的疗效，且复发率低。近年来研究证实，丹参主要有效成分丹参酮ⅡA除具有抗氧化、抗菌消炎及抗心脑血管疾病等作用外，还对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，并可促进其凋亡、抑制其恶性增殖[13-14]；同时，丹参可清除氧自由基、降低血液黏稠度、扩张血管、减少血小板聚集、改善血液流变学，抑制成纤维细胞增殖，并促其凋亡，局部用药可诱导新生毛细血管形成、维持血管内皮细胞膜完整性等作用。赵雁焕等[15]对口腔黏膜下纤维变性患者于口腔黏膜病变区域注射曲安奈德及丹参注射液，疗效显著，并明显减轻了疼痛程度。本研究结果显示，治疗2个月后观察组总有效率为80.88%，显著高于对照组的63.24%；治疗4个月后观察组总有效率较治疗2个月后明显升高，且高于对照组，治疗后随访期间，观察组复发1例，对照组复发7例，2组复发率差异有统计学意义。表明丹参片联合常规西药治疗OLK效果优于单纯西药治疗，且疗效维持时间久，治疗后复发率低。

OLK的癌变过程是一个多因素的连续的病理过程，期间由正常口腔黏膜至黏膜异常增生、原位癌变至疾病进展至浸润癌。有研究显示，OLK的上皮异常增生的程度越重，癌变的风险就越大[16]。MMP-2及MMP-9是MMP家族中唯一可以降解Ⅳ型胶原的明胶酶类，MMP-2是由结缔组织细胞分泌的，能够降解细胞外基质，与MMPs结构上具有较大同源性，在肿瘤侵袭、转移过程中发挥一定的作用[17]。已有研究显示，MMP-2的过度表达在多种肿瘤组织中均可检测出来，并发现与肿瘤的侵袭转移相关，对预测肿瘤转移以及复发的风险有一定的价值[18-19]。MMP-9通过破坏基质降解平衡，促使癌细胞穿越组织学屏障，促进肿瘤细胞侵袭其邻近周围组织及向远处正常组织转移[20]。本研究免疫组织化学染色结果显示，MMP-2、MMP-9阳性着色主要为棕黄色染色，染色部位主要位于细胞质；与健康对照组比较，OLK患者局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显升高，表明患者口腔黏膜组织基底膜及其组织屏障已经受到破坏，癌变率大大增高；与治疗前比较，治疗2个月及4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9阳性表达率明显降低，且治疗4个月后观察组局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率低于对照组；对照组仅治疗4个月后局部黏膜组织中MMP-2阳性表达率较治疗前降低。表明丹参片联合常规西药治疗OLK可能是由降低黏膜局部组织中MMP-2和MMP-9的表达起到改善临床症状和修复组织细胞的作用，同时对抑制其癌变的进展起到积极的作用。

综上所述，丹参片联合常规药物治疗OLK效果显著，可降低局部黏膜组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平，对短期内抑制组织癌变具有一定的积极作用。

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（2018-06-25收稿 责任编辑：杨觉雄）