ARRDC3预测人类前列腺癌进展和预后的相关性研究

郑煜　林卓远　陈潮江　李健新

【摘要】目的確定含抑制结构域的蛋白3（ARRDC3）与微小核糖核酸-30d（miR-30d）在前列腺癌中的表达及ARRDC3的高低表达与前列腺癌进展和预后的相关性，探讨ARRDC3抑制前列腺癌进展的相关机制。方法采用实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测转染后的抑制表达和过表达miR-30d细胞株中ARRDC3 mRNA和蛋白表达情况，分析Taylor数据库中ARRDC3表达水平与前列腺癌患者的临床特征和预后的关系，构建ARRDC3抑制表达和过表达的DU145和LNCaP细胞株，分别采用细胞增殖实验、划痕实验、侵袭实验分析ARRDC3对前列腺癌细胞功能的影响。结果实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析结果显示，ARRDC3 mRNA及蛋白表达水平在抑制表达miR-30d的LNCaP细胞株中均上调（P均<0.001），在过表达miR-30d的LNCaP细胞株中均下调（P均<0.001）。Taylor数据库分析显示，生化复发、术后淋巴结转移和高Gleason评分值者的ARRDC3 mRNA表达水平较低（P均<0.05）。Log-rank检验显示，术后无生化复发者ARRDC3 mRNA表达水平高（P<0.05）。细胞增殖实验结果显示，LNCaP与DU145细胞中，与无过表达ARRDC3（NC组）比较，过表达ARRDC3（ARRDC3组）的OD450均较低（P均<0.001）；与无抑制ARRDC3表达（KO-NC组）比较，抑制ARRDC3表达（KO-ARRDC3组）的OD450均较高（P均<0.001）。LNCaP与DU145细胞划痕实验及侵袭实验结果均显示，与NC组比较， ARRDC3组的移行细胞数及穿膜细胞数较少；与KO-NC组比较， KO-ARRDC3组的移行细胞数及穿膜细胞数较多。结论ARRDC3为前列腺癌的抑癌基因，并与前列腺癌淋巴结转移和术后生化复发有关，可作为前列腺癌进展和预后预测的标志物。

【关键词】ARRDC3；前列腺癌；预后

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression levels of ARRDC3 and miR-30d in prostate cancer， analyze the correlation between the expression of ARRDC3 and the progression and prognosis of prostate cancer and investigate the mechanism of the inhibitory effect of ARRDC3 upon the progression of prostate cancer. MethodsThe expression of ARRDC3 at the mRNA and protein levels was measured by real-time quantitative PCR and Western blot in the cell lines with down-regulating and over-expressing miR-30d after transfection. The relationship between ARRDC3 expression in the Taylor database and the clinical characteristics and prognosis of prostate cancer patients was analyzed. The DU145 and LNCaP cell lines with down-regulating and overexpressing ARRDC3 were established. The effect of ARRDC3 upon the function of prostate cancer cells were analyzed by cell proliferation assay， scratch assay and invasion assay. ResultsReal-time quantitative PCR and Western blot demonstrated that the expression levels of ARRDC3 mRNA and protein were significantly up-regulated in the LNCaP cell lines after the expression of miR-30d was down-regulated （both P<0.001）， whereas remarkably down-regulated in the LNCaP cell lines when miR-30d overexpressed （both P<0.001）. Taylor database analysis revealed that the expression level of ARRDC3 mRNA was significantly down-regulated in the patients with biochemical recurrence， postoperative lymph node metastasis and high Gleason score （all P<0.05）. Log-rank test showed that a higher expression level of ARRDC3 occurred in the patients without postoperative biochemical recurrence （P<0.05）. Cell proliferation assay demonstrated that the OD450 of LNCaP and DU145 cells overexpressing ARRDC3 （ARRDC3 group） was significantly lower compared with that of LNCaP and DU145 cells without overexpression of ARRDC3 （NC group） （P<0.001）. Compared with the cells without down-regulation of ARRDC3 expression （KO-NC group）， the OD450 of the cells down-regulating the expression of ARRDC3 （KO-ARRDC3 group） was significantly higher （P<0.001）. Cell scratch and invasion assay indicated that compared with the NC group， the quantity of of migrating and trans-membrane cells was significantly lower in the ARRDC3 group. Compared with the KO-NC group， the quantity of migrating and trans-membrane cells was significantly higher in the KO-ARRDC3 group. ConclusionsARRDC3 is an anti-oncogene of prostate cancer， which is associated with lymph node metastasis and postoperative biochemical recurrence of prostate cancer. ARRDC3 can be considered as a marker for predicting the progression and prognosis of prostate cancer.

【Key words】ARRDC3； Prostate cancer； Prognosis

由于前列腺癌具有发展慢、发病隐匿的特点，早期可无症状，目前血清前列腺特异性抗原（PSA）的检测是筛查前列腺癌最重要的参考指标，但是其对前列腺癌早期诊断的灵敏度和特异度并不理想。最近国内外专家对前列腺癌筛查的标志物研究层出不穷，而且在利用生物标志物筛查前列腺癌术后淋巴结转移和预测复发方面的研究也取得了突破性进展[1-3]。研究已经证实微小RNA-30d（miR-30d）可促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[4]。目前有关ARRDC3在肿瘤的报道主要集中在其作为肿瘤抑制基因抑制乳腺癌的进展[5-6]。我们利用基因表达谱芯片技术在LNCaP和DU145细胞株中分析过表达miR-30d的差异表达下调基因，其中含抑制结构域的蛋白3（ARRDC3）表达明显下调。为此，本研究检测了ARRDC3与miR-30d在前列腺癌中的表达关系及ARRDC3表达高低与前列腺癌进展和预后的相关性，探讨其抑制前列腺癌进展的相关机制。

材料与方法

一、 材料

BLAB/c裸鼠8只（SPF级，体质量15.0～21.5 g），雄性，4～6周龄，购于中山大学实验动物中心。2种前列腺癌细胞株（DU145/LNCaP）购买于美国种质保藏中心（ATCC）公司。

二、主要试剂和仪器

脂质体Lipofectermine 2000购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司，rTaq DNA聚合酶、逆转录试剂盒（Prime ScriptTM RT Reagent Kit）、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均为TAKARA公司产品；用于抑制ARRDC3表达的KO-ARRDC3及其空白对照KO-NC均购置于美国CST公司，ARRDC3抗体（BS-8077R）购于北京博奥森公司。iCycler iQ5荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司，Nano Drop ND-1000微量核酸定量仪购自美国Thermo公司；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Woundhealing和Transwell小室购自美国Corning公司。

三、方法

1.ARRDC3 mRNA及蛋白表达水平的检测

按照RNA提取试剂盒说明书提取抑制表达和过表达miR-30d的LNCaP细胞株中总RNA并进行逆转录，根据仪器所提供的实验方案配置SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，β-actin作为内参，按照PCR实验方案进行操作，实时荧光定量PCR检测miR-30d的表达相对定量值；抑制表达和过表达 ARRDC3的蛋白表达量检测采用蛋白免疫印迹法，通过SDS-PAGE分离含有40 μg蛋白质的提取物并转移到Hybond硝酸纤维素膜上在含Tween-20的磷酸盐缓冲液中摇动，用5%脱脂奶粉封闭，抗ARRDC3探针进行检测，Super Signal West PICO化学发光检测系统观察结果。

2.Taylor数据库分析

Taylor临床前列腺癌组织基因芯片微列阵数据集（GSE21032，从NCBI的GEO公共基因芯片数据库下载），主要用于分析ARRDC3 mRNA的表达情况。所有前列腺癌及BPH患者取材前均未经化学治疗或放射治疗，含有详细临床资料的150例前列腺癌及29例良性前列腺组织。临床信息主要有年龄、病理分型、病理分组、Gleason评分、血清PSA、淋巴结转移、生存及生化复发情况等信息。前列腺癌的纳入标准：病理证实为前列腺癌，分期不限。BPH纳入标准：病理诊断为BPH。排除标准：已作手术去势者。将生化复发定义为：前列腺癌根治术后，未行辅助内分泌治疗及放疗的前提下，随访过程中连续2次血清PSA水平超过0.2 ng/ml。该数据库已经剔除了死因为非前列腺癌及其他意外事故死亡的患者。

3.细胞转染

按Lipofectermine 2000转染试剂说明将miR-30d的shRNA和NC转染至LNCaP细胞株中，ARRDC3的短发夹RNA（shRNA）和小干扰RNA（siRNA）以及各自相应空白对照物转染至DU145、LNCaP细胞株，构建过表达及抑制细胞株，进行细胞增殖实验、细胞侵袭实验及细胞划痕实验。引物序列：实验组中ARRDC3-1为TGTTGCTGGTTC-TGTACCTC， ARRDC3-2为AGCTTGTGGCTAACTTGCGT，ARRDC3-3为GCTTGTGGCTAACTTGCGTG；對照组为ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA。

四、统计学处理

使用SPSS 19.0处理数据，连续变量以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线的对比采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、过表达或抑制miR-30d对ARRDC3 mRNA和蛋白表达水平的影响

实时定量PCR显示，ARRDC3 mRNA表达水平在抑制表达miR-30d的LNCaP细胞株中上调（17.03±0.60 vs. 1.01±0.03，t=83.163、P<0.001），在过表达miR-30d的LNCaP细胞株中下调（0.10±0.05 vs. 1.00±0.03，t=-12.796、P<0.001），见图1A。蛋白免疫印迹法也显示同样的结果（P<0.001），见图1B。

二、ARRDC3表达水平与前列腺癌患者的临床特征和预后的相关性

Taylor数据库分析显示，生化复发、术后发生转移和高Gleason评分值者的ARRDC3 mRNA表达水平较低（P均<0.05），见表1。年龄、术前PSA水平、是否死亡和病理分期之间与ARRDC3的表达水平无关（P>0.05）。生存曲线显示，与术后生化复发者相比，术后无生化复发ARRDC3 mRNA表达者高较高（P<0.05）；ARRDC3 mRNA表达水平与术后患者的总体生存率无关（P>0.05），见图2。

1.细胞增殖实验结果

LNCaP与DU145细胞中，与无过表达ARRDC3（NC组）比较，过表达ARRDC3（ARRDC3组）的OD450均较低（t分别为56.711、22.420，P均<0.001），见图3A；与无抑制ARRDC3表达（KO-NC组）比较，抑制ARRDC3表达（KO-ARRDC3组）的OD450均较高（t分别为34.200、47.226，P均<0.001），见图3B。

2.划痕实验结果

LNCaP与DU145细胞中，与NC组比较， ARRDC3组的移行细胞数均较少；与KO-NC组比較， KO-ARRDC3组的移行细胞数较多，见图3C。

3.侵袭实验结果

LNCaP与DU145细胞中，与NC组比较， ARRDC3组的穿膜细胞数均较少；与KO-NC组比较， KO-ARRDC3组的穿膜细胞数较多，见图3D。

讨论

肿瘤标志物指由肿瘤细胞产生或受肿瘤刺激后由机体其他组织、细胞异常表达的物质，目前血清学方法检测肿瘤标志物已成为临床普遍应用且简便易行的理想检测方法之一。对肿瘤标志物异常升高者进行的早期全面诊断及干预，可有效提高肿瘤患者的生存率。多项研究显示，miR-30d表达水平在髓母细胞瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、卵巢癌中上调，并可作为促癌基因及预测指标判断肿瘤的预后、转移风险和临床进展[7-8]。我们前期在过表达miR-30d的基因表达谱分析中发现ARRDC3明显下调。ARRDC3是哺乳动物α-抑制蛋白家族的成员之一，由N末端抑制蛋白叶、C末端抑制蛋白叶和含有2个PPXY基序的C末端尾组成[9]。ARR-DC3包含抑制蛋白结构域蛋白家族的结构同源性，研究表明ARRDC3与硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）具有相同的抑制结构域，参与受体信号传导及内吞作用[10]。另一研究显示，ARRDC3在小鼠和人类细胞中也具有下调β2-肾上腺素能受体（β2AR）的作用，其主要定位于重组蛋白EEA1早期内体，它与ESCRT-0复合物相互作用，以不依赖配体的方式与β2AR结合并通过负调节β2AR进入循环回收小管，从而将其保留在EEA1-阳性早期内体，所以ARRDC3可调节受体依赖性G蛋白内体上的信号传导[11-12]。Nabhan等[13]认为，ARRDC3主要作用于质膜，其与β2-AR相互作用以激动剂依赖的方式和功能促进泛素连接酶Nedd4介导的泛素化和随后β2-AR的降解，进一步的研究显示ARRDC3与含各种HECT-域E3泛素连接酶的WW结构域相互作用，ARRDC3的第1个PPxY基序已经显示其与在体外具有高亲和力Nedd4结构域的第三WW相互作用。本研究利用实时定量PCR和蛋白免疫印迹法验证miR-30d与ARRDC3在前列腺癌中的调控关系，结果显示miR-30d在前列腺癌中负调控ARRDC3，有关miR-30d负调控ARRDC3的机制及两者的相互作用关系仍有待进一步深入研究探讨。

目前，ARRDC3已经被证明在肿瘤中起抑癌作用。最近有关ARRDC3抑癌机制的研究表明，ARRDC3功能在于控制细胞表面黏附分子ITGβ4（肿瘤抑制蛋白）的新型调控途径，ARRDC3与磷酸化的ITGβ4结合并导致其内化、泛素化和最终降解，ARRCD3-ITGβ4途径可作为乳腺癌新的治疗靶标[14]。有关ARRDC3在肿瘤方面的报道主要集中在其作为肿瘤抑制基因抑制乳腺癌的进展，而在前列腺癌方面的研究报道甚少。我们进一步使用前列腺癌临床芯片数据集（Taloy数据库）进行分析， 结果显示生化复发、术后转移和高Gleason评分值者ARRDC3 mRNA表达水平高，而低表达ARR-DC3者的术后生化复发率及术后转移发生率低于高表达者，提示ARRDC3在前列腺癌中起抑癌作用，ARRDC3表达水平下调可导致前列腺癌患者术后出现临床进展。生存分析显示，ARRDC3 mRNA低表达者的术后无生化复发率低于高表达者，但ARRDC3 mRNA表达与患者总体生存率无关，这可能由于所研究的基因数据库中前列腺癌患者的前列腺癌特异性病死率较低，影响了ARRDC3评估患者总体生存率的预测价值。

为了研究过表达和抑制表达的ARRDC3基因对前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等功能的影响，我们进行细胞功能实验，包括细胞增殖实验、划痕实验及侵袭实验。结果表明，与对照组相比，无论是在雄激素依赖性（LNCaP）还是在非雄激素依赖性（DU145）前列腺癌细胞中，过表达ARRDC3均能够抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，抑制表达的ARRDC3能增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力，证实ARRDC3能抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，对前列腺癌细胞起着抑癌的作用。

综上所述，ARRDC3为前列腺癌的抑癌基因，并与前列腺癌淋巴结转移和术后生化复发有关，可作为前列腺癌进展和预后预测的标志物。有关ARRDC3抑制前列腺癌进展的下游调控基因或通路，以及是否存在ARRCD3-ITGβ4调控通路仍有待进一步的研究探讨。

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（收稿日期：2018-01-17）

（本文編辑：林燕薇）