益气逐瘀方改善心肌梗死大鼠心肌损伤及对miR24/Bim通路相关蛋白表达的影响

褚福永　刘巍　尚菊菊

摘要目的：探討益气逐瘀方参元丹对急性心肌梗死大鼠心肌损伤及miR24/Bim通路相关蛋白表达的影响。方法：50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、参元丹高、中、低剂量组，每组10只，采用左冠状动脉前降支结扎法复制心肌梗死模型，参元丹高、中、低剂量组从术后第2天开始给予参元丹药液灌胃，假手术组和模型组给予等剂量生理盐水灌胃，共给药2周。治疗结束后检测大鼠血清CK、LDH水平及心肌组织miR24基因表达，超声心动图检测左室功能，Westernblot检测心肌组织Bim、Bcl2、Bax、caspase9蛋白表达。结果：实验结束时，与模型组比较，参元丹高、中、低剂量组均能显著降低血清CK、LDH水平（P<005，P<001），升高心肌组织miR24基因表达（P<005，P<001），降低左室舒张和收缩末期内径（P<005，P<001），升高左室短轴缩短率及射血分数（P<005，P<001），升高心肌组织Bcl2蛋白表达（P<005），降低Bim、Bax、caspase9蛋白表达（P<005，P<001）。结论：益气逐瘀方参元丹可能通过调控miR24/Bim信号通路相关细胞因子蛋白表达改善心肌梗死细胞损伤。

关键词益气逐瘀方；参元丹；细胞梗死；miR24

Effects of Yiqi Zhuyu Formula on Improving Cardiac Injury and miR24/Bim Signal Pathway Related Protein Expression in Myocardial Infarction Rats

Chu Fuyong，Liu Wei，Shang Juju，Liu Hongxu

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China）

AbstractObjective：To investigate the effects of Yiqi Zhuyu formula Shenyuan Dan （SYD） on myocardium injury biomarkers，cardiac function，miR24/Bim pathway protein expression in myocardial infarction rats.Methods：Fifty SD rats were randomly divided into five groups namely sham group，model group，high，middle，and lowdose SYD group，with 10 rats in each group.The rat myocardium ischemia model was established by ligating of anterior descending branch of coronary artery.The rats in treatment groups were performed with intragastric administration of SYD for 2 weeks.After the treatment，serum levels of creatine kinases （CK），lactate dehydrogenase （LDH），and cardiac function were measured.miR24 mRNA expression was measured by RTPCR.Bim，Bcl2，Bax and caspase9 protein expression in ischemic myocardium were measured by Westernblot.Results：At the end of the treatment，the serum levels of CK，LDH were significantly decreased in SYD （high，middle and lowdose） groups compared with those in model group （P<005，P<001）.The cardiac function was also improved with the LVEDD and LVESD significantly decreased （P<005，P<001），and the LVFS and EF significantly increased （P<005，P<001）.The expression of miR24 mRNA and Bcl2 protein in ischemic myocardium were significantly increased and the Bim，Bax，caspase9 protein were significantly decreased in SYD groups compared with those in model group （P<005，P<001）.Conclusion：Yiqi Zhuyu formula SYD could relieve myocardial injury and the possible mechanism may be related to adjusting miR24/Bim signal pathway and its related protein expression in ischemic myocardium.

Key WordsYiqi Zhuyu formula； Shenyuan Dan； Myocardial infarction； miR24

中图分类号：R242；R256；R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.005

冠心病发病的主要病理过程是心肌缺血，细胞凋亡是缺血早期细胞损伤的重要病理机制[12]。研究表明，miR24在心肌组织中高表达，并且能够通过调控下游Bim/caspase凋亡信号通路发挥心肌保护作用[3]。课题组前期研究发现，基于益气逐瘀法组方的参元丹（SYD）具有减轻心梗大鼠心肌损伤程度，上调缺血心肌组织miR24表达的作用[46]，然而其通过干预miR24介导的下游Bim/caspase信号通路发挥心肌保护作用的具体作用机制尚不清楚。本研究通过观察SYD对心肌梗死大鼠心肌损伤标志物、心功能、miR24/Bim通路相关蛋白表达的影响，探讨SYD改善心肌缺血细胞损伤的作用机制。

1材料与方法

11材料

111动物健康清洁级SD大鼠50只，体重（220±10）g，雌雄不限，购自北京市维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK（京）20132014。严格控制饲养条件，自由饮食，光照时间6：00～18：00，明/暗周期为12 h/12 h，温度（20±3）℃，背景噪声（40±10）db。

112药物SYD由丹参、党参、玄参、地龙、土鳖虫等组成，来源于北京中医医院中药制剂室。根据课题组前期研究资料[4]，将SYD除去包衣，溶于蒸馏水中，以10倍量常水煮提3次，30 min/次，合并煮提液，浓缩至含生药1 g/ mL的药液供用。

113试剂与仪器Trizol（Invitrogen）、MMLV逆转录酶（Promega），miR24逆转录试剂盒TransStart Green qPCR superMix（北京全式金生物技术有限公司），引物设计由Invitrogen公司完成，Bax、Bim、Bcl2、caspase9多克隆抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（美国Santa Cruz），GAPDH抗体（美国Santa Cruz）。小动物呼吸机（成都泰盟科技），全自动生化分析仪（美国BECKMAN），台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf），ABI 7300 Real time PCR儀（美国ABI），Thermo NanoDrop 2000型分光光度计（美国Thermo），倒置荧光显微镜（日本Olympus），-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo），TA1003型精密电子天平（上海天平仪器）。

12方法

121分组与模型制备采用冠状动脉前降支结法扎建立大鼠心肌缺血模型，具体方法参照课题组前期研究结果进行[4]，假手术组开胸后只穿线不结扎，术后每只大鼠给予青霉素钠20万U/d肌注预防感染。动物适应性喂养3 d，禁食12 h后进行随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、SYD高剂量组（HSYD）、SYD中剂量组（MSYD）、SYD低剂量组（LSYD），每组10只。

122给药方法从术后第2天开始给药，连续给药14 d。其中，SYD高、中、低剂量组分别按照12 g/（kg·d）、6 g/（kg·d）、3 g/（kg·d）给予SYD药液灌胃，假手术组和模型组分别给予等剂量的生理盐水灌胃。

123检测指标与方法实验结束时，大鼠戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血3 mL，分离血清。采血后大鼠麻醉处死，去除心房及右心组织，于结扎点以下沿心脏纵轴方向分别横切三份3～5 mm心肌组织，分装入DEPC处理的EP管后放入液氮中，-80 ℃超低温冰箱保存待检。全自动生化分析仪检测大鼠血清CK、LDH水平。超声心动图检测大鼠心功能，采用GE VIVID7超声显像仪（探头频率13MHz）于胸骨旁二维短轴平乳头肌水平采集左心室图像，测量左心室舒张期末内径（LVEDD）、左心室收缩期末内径（LVESD）、短轴缩短率（FS）及左心室射血分数（LVEF）。采用Real timePCR法检测心肌组织miR24 mRNA表达，以U6作为内参。心肌组织总mRNA提取参照Trizol试剂盒说明进行，每个样本取400 ngRNA模板合成cDNA。miR24引物序列：上游5′GCGGCGGTG GCTCAGTACA GC3′，下游5′GTGCAGGGTCCGAGGT3′；内参U6引物序列：上游5′GCTC GCTTCG GCAGCACA3′，下游：5′GAGGTA TTCGCACCAGAGGA3′，PCR反应条件：93 ℃2 min预变性，93 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，工作40次循环，最后72 ℃7 min延伸，反应结束后，通过产物的溶解曲线判定引物的特异性。调整基线和阈值读出各孔的循环数（Cycle Threshold，Ct），利用比较Ct法检测各样本mRNA的表达情况。Western blot检测心肌组织Bim、Bax、Bcl2、caspase9蛋白表达Western blot检测心肌组织Bim、Bax、Bcl2、caspase9蛋白表达，取30 mg心肌组织经过匀浆、裂解、超声破碎、高速离心后，取上清，采用考马斯亮蓝法在分光光度仪上测定蛋白浓度，分装后-20 ℃保存，为避免免疫印迹实验中标本蛋白量不同造成的影响，上述受体的免疫印迹结果用GAPDH进行校正。采用ImagePro Plus 41软件分析蛋白条带的吸光度[integrated absorbance，IA=平均吸光度（A）×面积]，以靶蛋白IA与GAPDH IA的比值反映靶蛋白水平。

13统计学方法采用SPSS 150进行统计分析，所有数据以（±s）表示，计量资料组内比较采用配对t检验，组间比较采用ANOVA方差分析，以P<005为差异有统计学意义。

2结果

21各组大鼠血清CK、LDH水平及心脏功能参数比较与假手术组比较，模型组大鼠血清LDH、CK明显升高（P<001），SYD高、中、低剂量组均能显著降低AMI大鼠血清CK、LDH浓度（P<005，P<001），且呈一定量效关系。见表1。与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD明显升高（P<001），FS、EF明显降低（P<001）。SYD高、中、低剂量均能够显著降低模型大鼠LVEDD、LVESD水平，升高FS，EF水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P<005，P<001）。见表2。

22大鼠心肌组织miR24基因表达比较与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织miR24表达水平显著下降（P<001）。SYD高、中、低剂量组均能够升高心梗大鼠心肌组织miR24表达，其中，SYD高、中剂量组和模型组比较，差异有统计学意义（P<005，P<001）。见表1。

23大鼠心肌组织Bim、caspase9、Bax、Bcl2蛋白表达比较与假手术组比较，模型组大鼠Bim、caspase9、Bax、Bcl2蛋白表达均明显升高（P<005）。SYD高、中、低剂量均能够显著降低大鼠Bim、Bax、caspase9水平，升高Bcl2水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P<005，P<001）。见表3、图1。

3讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病是最常见的人类死亡病因之一，其基本的病理生理过程是心肌缺血[7]。细胞凋亡是心肌缺血早期细胞损伤的重要病理机制，近来研究表明， miR24在哺乳动物心肌组织中高表达，并且在小鼠心肌缺血早期表达明显上调，并可能通过调控靶基因Bim及其下游线粒体细胞凋亡信号通路关鍵细胞因子基因和蛋白的表达参与了缺血心肌自身修复过程[89]；此外，我们前期的临床研究也发现，不稳定型心绞痛（UAP）和急性心肌梗死（NSTEMI、STEMI）患者外周血 miR24表达水平明显低于稳定型心绞痛和健康人群，miR24的表达与炎性反应和细胞凋亡因子呈明显的负相关，且随着冠脉病变支数和严重程度的增加，miR24的表达水平呈下降趋势[10]。由此可见，miR24与冠心病发病过程关系密切，miR24在冠心病心肌缺血发病过程中可能发挥了重要的调控作用。

本研究表明，心肌梗死后大鼠心肌组织由于缺血缺氧刺激，心肌损伤标志物CK、LDH和细胞凋亡水平明显升高，miR24表达明显降低，通过调控靶基因Bim及下游凋亡因子Bax、Bcl2、caspase9表达参与调控细胞凋亡。参元丹能够有效降低心肌梗死大鼠血清CK、LDH的水平，改善心功能，通过上调miR24其下游抑凋亡因子Bcl2表达水平，下调Bim及其下游促凋亡因子Bax、caspase9表达水平发挥减轻心肌缺血细胞损伤的作用，且呈一定量效关系。本研究初步证实了参元丹具有减轻心梗大鼠心肌细胞损伤及细胞凋亡的作用，其机制可能与其上调心梗大鼠缺血区miR24表达，从而抑制其靶基因Bim及下游促凋亡因子Bax、caspase9基因表达有关。本研究将为益气逐瘀法在冠心病心肌缺血中的应用提供实验依据，也为临床上探寻冠心病新的治疗方法和药物靶点提供思路。

参考文献

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（2018-07-20收稿责任编辑：徐颖）