缺氮胁迫下雨生红球藻虾青素积累过程中的基因组MSAP分析

张克亚 卿人韦 柳科欢 刘倩倩 侯兴国 兰利琼

摘 要： 虾青素具有多种生物学活性，雨生红球藻为天然虾青素的最佳来源，缺氮胁迫会导致雨生红球藻积累虾青素。为了解缺氮条件下雨生红球藻虾青素积累的分子机制，该研究通过对雨生红球藻进行缺氮胁迫，结合MSAP法，研究了雨生红球藻在缺氮胁迫下虾青素积累过程中基因组甲基化水平的变化，结果表明：缺氮胁迫0～72 h期间，雨生红球藻生长速度减慢，而虾青素积累主要发生在缺氮处理12～24 h期间，随后积累速度减慢。同时，对缺氮胁迫0、24、72 h的雨生红球藻基因组DNA進行甲基化敏感扩增多态性分析，共得到了291个甲基化多态性位点，其中发生甲基化变化的位点在0～24 h和24～72 h分别占总位点的29.90%和53.95%。在缺氮胁迫24 h处DNA半甲基化率最大（为12.71%），全甲基化率最低（为26.80%）；缺氮胁迫72 h处DNA全甲基化率最高（为28.52%），半甲基化率最低（为1.72%）。这表明DNA甲基化调节方式的改变是虾青素积累过程中的一种重要调控模式。

关键词： 藻类学， 缺氮胁迫， 雨生红球藻， 虾青素， 甲基化变化

中图分类号： Q948 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1155-09

Abstract： Haematococcus pluvialis is the best resource for natural astaxanthin， which has multiple biological functions. Nitrogen depletion can result in astaxanthin accumulation in H. pluvialis. In order to explore the molecular mechanism of astaxanthin accumulation in H. pluvialis under nitrogen depletion stress， the growth rate of the algae was found to decrease during 0-72 h， the accumulation of astaxanthin mainly occured during 12-24 h， and then slowed down. MSAP analysis of stress time point at 0， 24 and 72 h got 291 methylation polymorphism loci， among which 29.90% of 0-24 h methylation loci and 53.95% of 24-72 h methylation loci changed. After 24 h of nitrogen depletion stress， the DNA semi-methylation rate was the highest （12.71%）， and the full-methylation rate got the lowest （26.80%）. On the contrary， full-methylation rate was the highest （28.52%） and the semi-methylation rate was the lowest （1.72%） after 72 h stress. DNA methylation changes appeared to be a vital regulation for astaxanthin accumulation.

Key words： phycology， nitrogen depletion stress， Haematococcus pluvialis， astaxanthin， methylation change

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水生长的单细胞绿藻，属于绿藻门绿藻纲团藻目红球藻科红球藻属。在不利环境中（如强光、高盐、高温、营养盐缺乏），会形成较大的厚壁孢子积累虾青素，并失去鞭毛成为不动细胞（段良飞等，2017）。虾青素（astaxanthin）是一种属于叶黄素类（xanthophylls）的类胡萝卜素，呈深粉红色，化学结构类似于β-胡萝卜素（Martinez-Delgado et al，2017），广泛存在于虾、蟹、鱼以及某些鸟类的羽毛中，除具有着色功能外，还有很强的抗氧化、清除自由基等方面的能力，能保护细胞免受氧化损伤。虾青素有三种立体异构体，即3S，3′S；3R，3′R；3R，3′S（分别为左旋、右旋、内消旋）（Ambati et al，2014）。雨生红球藻（H. pluvialis）中多为（3S，3′S）异构体（Wan et al，2015）。Liu et al（2016）研究表明，虾青素三种立体异构体的抗氧化活性依次为（3S，3′S）>（3R，3′R）>（3R，3′S）。目前，自然界中天然的虾青素主要存在于某些藻类、酵母和细菌中，其中雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源（赵晓燕等，2016）。虾青素因其具有高效生物学活性，而成为近年来国内外的研究热点。

基因组DNA甲基化能维持植物基因组功能稳定以帮助植物抵抗逆境（马浪浪等，2013），还能调节植物的正常生长发育、改变植物春化作用，促进开花，引起转基因沉默等（黄禄君等，2009）。甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）是在扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）的基础上发展而来（Vos et al，1995），利用同裂酶HpaⅡ/Msp I对识别序列CCGG的甲基化敏感性不同，产生不同的DNA切割片段来揭示甲基化位点（李娜等，2012）。由于该法成本低、灵敏度高，不受基因组序列的限制，检测位点多并能同时分析多个样品（熊肖等，2017），目前已越来越多地应用于检测植物基因组DNA甲基化水平，在植物表观遗传学的研究中具有良好的应用前景。现今对雨生红球藻的研究致力于其高效培养（Jaime Fábregas et al，2001；Zhang et al， 2014；陈兴才等，2005），虾青素的积累和提取条件探究（段良飞等，2017；李小慧等，2015）以及虾青素积累结构——质体球滴的观察与质体球滴结构蛋白的基因克隆等（范勇等，2012），对缺氮条件下雨生红球藻虾青素积累过程中的基因组MSAP分析尚未见报道，而这些研究对揭示雨生红球藻在缺氮条件下虾青素积累的具体机制具有重大意义。本研究通过对雨生红球藻进行缺氮胁迫，结合MSAP法，探究雨生红球藻在缺氮胁迫下虾青素积累过程中的基因组甲基化水平变化，初步揭示雨生红球藻对缺氮胁迫的适应机制，对深入研究氮胁迫下雨生红球藻虾青素积累机理提供一定的理论基础，并丰富藻类在表观遗传学上的研究内容。

1 材料与方法

1.1 材料

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）藻种，由四川大学生命科学学院藻类实验室培养并保存。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 采用BBM培养基，培养方式为通气（V空气∶VCO2=98∶2），温度（22±1）℃，光暗周期12 h∶12 h，光照强度900～1 100 lx。正式实验前先进行预培养：将处于对数生长期的藻按1∶10比例接种，通气培养至对数生长期。正式实验时按1∶6的比例转至1 L三角瓶内培养，待培养至对数生长期后，将藻离心收集，藻泥全部转移至等体积新配的BBM缺氮培养基中进行胁迫，对照组用BBM全培养基进行正常培养。

1.2.2 细胞计数及显微观察 将对照组和缺氮胁迫组的雨生红球藻在培养至0、12、24、48、72 h时分别取样，用显微镜观察藻细胞形态并用血球计数板测定藻细胞数目。

1.2.3 虾青素含量测定 将对照组和缺氮胁迫组的雨生红球藻在培养至0、12、24、48、72 h时分别取样，进行虾青素含量测定。采用改进的美国Cyanotech公司的方法（陈晓飞和严小军，2007）：藻泥于15 mL离心管中烘干后，加入1 g石英砂和5 mL DMSO，45～50 ℃水浴30 min，此期间每5 min涡旋振荡30 s（共6次）。3 500 r·min-1下离心5 min使细胞物质沉淀，上清转入10 mL容量瓶中。往离心管中加入1 mL丙酮，涡旋振荡30 s。 3 500 r·min-1下离心5 min使细胞物质沉淀，将上清液转入10 mL容量瓶中，丙酮至少抽提3次，直到上清液基本无色（吸光值小于0.05）。用丙酮定容至10 mL，将容量瓶上下颠倒混匀，吸取5～10 mL放入离心管，3 500 r·min-1下离心5 min以除去前面步骤中带入的颗粒物。474 nm波长下测定最大吸光值（丙酮作空白对照）。若吸光值大于1.25，则必须对样品用丙酮稀释后再测，稀释倍数一般为1∶5～1∶10。每组3个重复。计算公式如下：

类胡萝卜素质量（mg）=最大吸光值A250 × 10 mL（丙酮） × 稀释倍数；

虾青素含量=类胡卜素（mg）样品质量（mg） × 80%。

1.2.4 MSAP分析 将缺氮处理0 h（胁迫处理前，作为对照）、24、72 h的雨生红球藻用Ezup柱式植物基因组DNA试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行DNA提取，参照Xiong et al（1999）的方法改进后进行酶切、连接、预扩增、选择性扩增及电泳。MSAP分析所采用的接头序列、预扩增引物及选择性扩增引物序列见表1。接头和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，限制性内切酶购自Thermo公司，T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司，PCR mix购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。

对提取的DNA分别进行EcoR I/Hpa Ⅱ和EcoR I/Msp I 2个组合酶切。酶切总反应体系20 μL：EcoR I 10 U，Hpa Ⅱ & Msp I 10 U，10×Tango buffer 4 μL，DNA样品300 ng，ddH2O补足20 μL。37 ℃酶切10 h。酶切反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。接着进行接头连接，连接体系总共20 μL：酶切产物10 μL，EcoR I 接头（5 μmol·L-1）与Hpa Ⅱ（Msp I）接头（50 μmol·L-1）各1 μL，T4 DNA Ligase 350 U，10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL，ddH2O补足20 μL。16 ℃连接12 h。连接产物稀释10倍后进行预扩增。预扩增体系20 μL，包括预扩增引物E0（10 μmol·L-1）1 μL，H/M0（10 μmol·L-1）1 μL，连接产物10倍稀释液5 μL，2×PCR mix 10 μL，双蒸水补足20 μL。扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，将预扩增产物稀释30倍进行选择性扩增。选择性扩增体系20 μL，包括EcoR I选择性扩增引物（10 μmol·L-1）1 μL，H/M选择性扩增引物（10 μmol·L-1）1 μL，预扩增产物30倍稀释液5 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O补足20 μL。扩增程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，65 ℃（每个循环降0.7 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，共12个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共25个循环；72 ℃ 10 min。选择性扩增产物经变性后，取2～3 μL进行6%变性聚丙烯酰胺凝膠电泳，电泳结束后按高东等（2009）的方法改进后进行银染，拍照并保存结果。电泳结果中，将Hpa Ⅱ/Msp I 酶切产物的条带进行标记，无条带记为“0”，有条带记为“1”。统计各类型条带数目，用Excel 2013进行结果分析。

2 结果与分析

2.1 雨生红球藻在缺氮胁迫下的生长曲线与显微观察

雨生红球藻在正常BBM和缺氮的BBM培养基中的生长情况如图1所示。整个过程中，正常培养条件的雨生红球藻生长状态良好，至72 h时，细胞数量每毫升已达13.2×105个； 而缺氮组的红球藻生长速度下降，生长减慢，到末期（72 h），细胞数量每毫升为8.7×105个，为对照组的0.66倍。

显微观察结果如图2所示。在缺氮胁迫0～24 h期间，雨生红球藻外观变化不显著，至胁迫72 h时，显微镜下可见藻细胞内部已有少量虾青素积累。

2.2 虾青素含量变化

图3为缺氮过程中虾青素含量变化情况。由图3可见，缺氮组的虾青素含量在整个实验过程中一直高于对照组，且缺氮组在胁迫处理12～24 h阶段虾青素含量急剧增加，为增幅最大的时段。此后，缺氮组虾青素含量上升减慢，趋于稳定。缺氮组与对照组在胁迫72 h处差异最大，此时缺氮组的虾青素含量为对照组的2.64倍。

2.3 缺氮胁迫下雨生红球藻DNA的MSAP分析

将11对选择性扩增引物组合进行雨生红球藻DNA样品的全基因组甲基化分析（图4）。对上述胶图进行条带统计后，按Tang et al（2014）的方法进行分类，具体分类如表2所示。甲基化一共有四种类型：（I） Hpa Ⅱ 和Msp I 处均有带（1，1），即没有发生甲基化；（Ⅱ） Hpa Ⅱ 无带， Msp I 有带（0，1），为内部胞嘧啶发生全甲基化；（Ⅲ） Hpa Ⅱ 有带， Msp I 无带（1，0），为外侧胞嘧啶半甲基化；（IV） Hpa Ⅱ和Msp I处均无带（0，0）， 为超甲基化位点。经统计后，得到各类条带数目如图5 所示。共得到1 265个条带，从这些条带中得到291个甲基化多态性位点。I类（未发生甲基化）数目最多，在缺氮处理 0、24、72 h 时分别为194、176、203个；Ⅱ类在缺氮处理的三个时间点变化不大；Ⅲ类在缺氮胁迫24 h和72 h时减少了86.49%，变化显著；IV类较稳定，在缺氮处理72 h时达64个，在三个时间点中数目最多。

对所得条带进行甲基化率分析，统计时将Ⅱ与IV类型视作全甲基化，总甲基化率 = [（Ⅱ+Ⅲ+IV）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，全甲基化率 = [（Ⅱ+IV）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，半甲基化率 = [（Ⅲ）/（I+Ⅱ+Ⅲ+IV）] × 100%，所得结果见表3。表3结果表明，缺氮处理24 h的总甲基化位点数最多 （115个）， 总甲基化率最高（39.52%）； 缺氮处理72 h的总甲基化位点最少（88个），总甲基化率最低（30.24%），显示在处理24～72 h期间，基因组总甲基化率下调了23.48%。全甲基化位点数在缺氮处理0、24、72 h 之间差异不大，全甲基化率在 26%～28%。半甲基化位点数在缺氮处理0、24、72 h分别为16、37、5个，显示在缺氮24 h处半甲基化率最大（12.71%），比0 h处上升了131.25%，而比72 h处下降了86.47%，变化显著。

对胞嘧啶发生甲基化和去甲基化变化的位点模式进行统计（表4）。通过表4分析发现，缺氮胁迫下的胞嘧啶甲基化和去甲基化变化共包括三种模式：（1）甲基化位点无变化。在缺氮处理0～24 h和24～72 h期间，甲基化位点无变化的数目分别为204和134个，各占总甲基化位点的70.10%和46.05%。（2）位点发生甲基化。缺氮处理0～24 h 期间发生甲基化的位点有46个，占总甲基化位点的15.81%；缺氮处理24～72 h期間发生甲基化的位点有73个，占25.09%。（3）位点发生去甲基化。缺氮处理0～24 h 期间发生去甲基化的位点有41个，占14.09%；缺氮处理24～72 h期间发生去甲基化的位点有84个，占28.87%。结果显示，291个多态性位点在0～24 h期间有87个发生了甲基化或去甲基化变化，占29.90%；24～72 h期间发生甲基化或去甲基化变化的位点有157个，占53.95%。可见，在缺氮处理过程中基因组DNA同时发生甲基化和去甲基化，且在后期（24～72 h）发生该变化的位点数更多。

3 讨论

氮元素是植物生长发育和发育过程中必不可少且需求量最大的元素，对细胞的构成、分裂、生长都有着重要作用，被称为“生命元素”（陈雅君等，2013）。氮元素是影响多种微藻生长和脂质积累最重要的元素（Griffiths & Harrison，2009）。本研究中，缺氮条件下的红球藻生长速度减慢， 这与庄惠如等（2000）研究中“在接种后3 d，缺氮处理组生长明显延缓”的现象一致。黄水英等 （2009）发现，缺氮条件下雨生红球藻积累虾青素的同时并未大量形成孢子，而是在游动细胞阶段积累虾青素，这与本研究缺氮处理72 h时显微观察到的雨生红球藻细胞并未形成厚壁孢子吻合。

缺氮胁迫下，雨生红球藻生长减慢，但虾青素含量却一直增加，表明缺氮有助于虾青素的合成，这与庄惠如等（2000）和Borowitzka et al（1991）研究结果一致，其机制可能是因为缺氮胁迫引起细胞内活性氧水平增加（Mendesferreira et al，2010），形成氧化胁迫，藻细胞快速、大量合成虾青素等抗氧化物质清除细胞内的活性氧（王潮岗等，2012），维持细胞内活性氧的动态平衡。此外，缺氮还会增加某些绿藻的脂质体含量（Hirooka et al，2014），而脂质体正是虾青素在雨生红球藻细胞质中储存的场所（Makio，2003），这也是缺氮胁迫导致虾青素积累的原因之一。

MSAP结果显示，四种甲基化类型中，I类（未发生甲基化）条带数最多，其次为IV类（超甲基化）。分析发现，在缺氮处理24 h处半甲基化率最高（达12.71%），全甲基化率最低（为26.80%），而缺氮12～24 h期间虾青素含量急剧增加，表明缺氮初期，虾青素积累可能主要以基因组 DNA半甲基化调节为主。缺氮处理72 h时，虾青素仍在积累，但积累速度缓慢，此时基因组DNA全甲基化率最高，推测此时主要以全甲基化调节为主。

DNA甲基化与去甲基化可以调节基因的表达，此过程中可能将外源DNA沉默，以保持基因组的完整，使植物体正常生长代谢，更好地适应外界环境（刘冰，2013）。通常，基因发生甲基化会抑制表达，发生去甲基化会增加转录水平，促进基因表达（Ik et al，1997）。本研究中，为适应缺氮胁迫，藻细胞DNA在0～24 h期间发生甲基化的位点多于去甲基化位点，表明激活表达的基因（如虾青素合成途径中相关基因）少于被抑制的基因，缺氮胁迫更多地抑制了基因的表达。王小利等（2015）发现，经缺氮处理后高羊茅甲基化率高于去甲基化率，表明高羊茅适应缺氮胁迫时，除激活抗逆基因的表达外，更涉及沉默部分基因的表达。本研究缺氮胁迫24～72 h期间，发生去甲基化的位点多于甲基化位点，以去甲基化为主，此时虾青素积累速度缓慢，可能随虾青素不断积累，相关基因陆续启动，发生去甲基化而被激活。可见，缺氮胁迫下的虾青素积累与基因组DNA甲基化相关，通过甲基化和去甲基化的方式调控基因的表达，从而影响虾青素的合成。

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