三叶木通微卫星分子标记开发及评价

李同建 董婧 廖亮 金洪光 韩兴杰 文锋 徐玲玲

摘 要： 为了获得适于三叶木通遗传多样性和遗传结构研究的微卫星分子标记，该研究采用磁珠富集法构建了三叶木通微卫星富集文库。结果表明：在150个阳性克隆中发现了70个微卫星位点，富集效率为46.67%，其中含双碱基重复单元的序列占比为79.37%，三碱基和四碱基重复含有量较少。共设计引物63对，其中筛选出16对高多态引物，对1个三叶木通自然居群48个个体进行了遗传分析，结果显示位点的等位基因数为10～22个，观察杂合度和期望杂合度分别为0.370～0.792和0.724～0.936，多态性信息指数为0.725～0.919，表明以上引物均为高多态性引物。其中，12个位点偏离哈迪-温伯格平衡，呈现出纯合子过剩状态，这可能与哑等位基因和其它因素有关。综上结果表明，该研究所开发的16对引物能够用于三叶木通遗传多样性和遗传结构评价工作。

关键词： 三叶木通， 微卫星分子标记， 磁珠富集法

中图分类号： Q943.2， Q75 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1117-08

Abstract： Akebia trifoliata is perennial， woody vine producing large edible fruits. The high medicinal and nutritional values of A. trifoliata make it worthy of being exploited as a new crop. Wild resources of these species have been se-riously deteriorated due to years of disorder planting and over-harvesting， thus wild germplasm resources protection and evaluation are particularly important. In order to obtain suitable molecular markers for genetic structure and genetic diversity of the existing resources， enriched SSR library was established using the magnetic bead enrichment procedure. Seventy SSR loci were obtained in 150 positive clones， and enrichment efficiency was 46.67%. Thereinto， sequences with two-base repeat unit accounted for 79.37%， far more than sequences with three-base and four-base. Sixteen pairs of high polymorphic primers were chosen in sixty-three pairs primers and characterized by 48 individuals collected in Lushan. The allele numbers per locus ranged from 10 to 22， and the observed and expected heterozygosity ranged from 0.370 to 0.792 and from 0.724 to 0.936， respectively， polymorphisms information content ranged from 0.725 to 0.919， which showed that the above primers were high polymorphic primers. Twelve pairs of primers deviated from Hardy-Weinberg equilibrium， showing excess of homozygotes， which might be related to null genes and other reasons. These molecular markers will contribute to evaluation on genetic diversity and population structure， lay a foundation for conservation and evaluation of A. trifoliata genetic resource.

Key words： Akebia trifoliata， microsatellite marker， magnetic bead enrichment

三葉木通（Akebia trifoliata）是木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia Decne.）的一种半落叶木质藤本缠绕植物，分布于秦岭以南至南岭，西至云南，东至浙闽16个省广大亚热带地区（万明长等， 2008）。其种下划分为三叶木通（A. trifoliata subsp. trifoliata）、白木通（A. trifoliata subsp. australis）、长萼三叶木通（A. trifoliata subsp. longisepala） 3亚种（中国植物志编辑委员会， 2001）。木通属植物具有利尿、镇痛、祛风湿的功效，作为中药有两千多年的历史（冯航， 2010； 李丽等， 2010； 李丽， 2010）。近期研究表明，其还具有抗衰老、提高免疫功能、抑制肿瘤等功效（An et al， 2016）。木通属植物果实较大，果肉甜糯，具有极高开发价值，在湖南、江西、贵州等地已有农户开始种植（罗克明等， 2008）。其种子含油量达40%，具有较高的食用价值（仲伟敏和马玉华， 2016）。与其高开发价值不匹配的是三叶木通种质资源研究较晚，大规模无序的种植、开发对野生种质资源造成巨大威胁。因此，有必要深入研究三叶木通种质资源，利用现代育种技术培育栽培品种，为三叶木通资源的可持续利用和种植产业起步打下基础。九江学院在中国、日本和韩国已搜集70余个不同产地的野生三叶木通资源，建设了三叶木通种质资源圃。但是，由于三叶木通分子生物学研究起步较晚，GenBank中仅能检索到440余条DNA序列，可用的分子标记较少，严重阻碍了资源的评价工作，因此急需开发合适的分子标记对现有资源进行遗传结构和遗传多样性评价（Li et al， 2009； Sun et al， 2016； 黄佩蓓等， 2016）。

微卫星分子标记具有多态性高、共显性、重复性好、条带少易识别等诸多优点，是目前遗传多样性和遗传结构研究中的首选标记之一（Grover & Sharma， 2016），随着荧光毛细管电泳技术在微卫星检测中的应用，微卫星标记变得更加高效和廉价（Wenz et al， 1998）。本研究拟采用 三叶木通微卫星分子标记，并利用7个不同产地的三叶木通个体和1个三叶木通自然居群检测引物的稳定性和多态性，以期获得适于三叶木通遗传多样性和遗传结构研究的微卫星分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集 在人工种植基地采集栽培三叶木通个体7个，用于检测微卫星引物扩增稳定性和多态性。在九江庐山采集三叶木通自然居群1个（n=48），用于微卫星文库建立和后期引物评价（表1）。采集每个个体新鲜、健康的幼嫩叶片放入装有变色硅胶的自封袋中迅速干燥，置于-20 ℃低温冰箱中保存备用。凭证标本保存于九江学院药学与生命科学学院分子生物学研究室。

1.1.2 试剂 10×PCR buffer、25 mmol·L-1 MgCl2、dNTPs、DNA Taq聚合酶（5 U·μL-1）均购自上海生工生物（Sangon Biology）工程有限公司；限制性内切酶Rsa I（10 U·μL-1）、BstU I（10 U·μL-1）、Xmn I（20 U·μL-1）購自New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase（400 U·μL-1）购自Promega公司； DNA Marker购自大连Takara公司； 接头引物SuperSNX24-F （5′-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGCAGAATC）和Super-SNX24-R （5′-GATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA）由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 已干燥的三叶木通样本采用改良的CTAB法提取总DNA（Doyle & Doyle， 1987），并利用PEG8000纯化，详细步骤为将40% PEG8000与5 mol·L-1 NaCl按1∶1比例配置成工作液，与等比例的DNA溶液混合，摇匀并置于37 ℃下静置15 min，12 000 r·min-1离心16 min，沉淀再由80%乙醇清洗2次，烘干。TE溶解后用Nanodrop检测合格后，置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 酶切与接头连接 使用限制性内切酶Rsa I或BstU I和Xmn I组合对三叶木通基因组DNA进行酶切，于37 ℃温浴过夜。酶切体系为25 μL：2.5 μL 10×T4 ligase buffer（NEB4），0.25 μL 100×BSA，0.25 μL 5 mol·L-1 NaCl，1.0 μL 10 U·μL-1 Rsa I/BstU I，1.0 μL 20 U·μL-1 Xmn I，20 μL 200 ng·μL-1 DNA。取1 μL酶切产物先用1%琼脂糖胶电泳检测酶切片段是否位于200～800 bp范围内；然后将SuperSNX24-F和SuperSNX24-R合成接头置于水浴锅中95 ℃反应5 min，缓慢冷却至室温；最后将制备好的接头与酶切产物连接。反应体系如下：7 μL接头，2.5 μL NEB 10×T4 ligase buffer，2.0 μL 350 U·μL-1 T4 ligase，13 μL酶切产物，加双蒸水至25 μL，16 ℃连接过夜。将连接产物作为模板，利用SuperSNX24-F接头作为引物通过PCR扩增检测连接结果。反应体系如下：2.5 μL 10×PCR buffer，0.13 μL 100 μmol·L-1 SuperSNX24-F，1.5 μL 2 mmol·L-1 dNTP，2.0 μL 25 mmol·L-1 MgCl2，2.5 μL BSA，0.2 μL 连接产物DNA，加双蒸水至25 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，循环24次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 杂交与磁珠富集 微卫星富集采用Glenn & Schable（2005）的方法，将连接产物与带生物素的探针混合物（AG）12、（CG）12、（AT）12、（GT）12、（ACT）12、（AAGT）8、（AACT）8、（AGAT）8进行杂交。杂交反应体系：25 μL 2×Hyb Solution，10 μL 10 μmol·L-1生物素标记的探针，10 μL连接产物，加双蒸水至50 μL。杂交反应程序：95 ℃预变性5 min；70 ℃开始，每个循环降低0.2 ℃，维持5 s，循环99次；50 ℃保持5 min；每个循环降低0.5 ℃，保持5 s，循环20次；15 ℃保持。用链霉素亲和磁珠（Promega Magne Sphere）捕获结合了生物素探针的DNA片段，用洗脱液洗脱未结合的探针。具体操作如下：250 μL TE 洗涤50 μL混匀的磁珠2次，50 μL 1×Hyb Solution平衡磁珠2次；将DNA和生物素探针混合物的杂交体系加入到磁珠中，于16 ℃下150 r·min-1振荡约1 h杂交；加入400 μL Wash Solution I洗脱2次，且第一次加入400 μL Wash Solution Ⅱ于45～48 ℃下水浴振荡2 min洗脱2次，再次加入400 μL Wash Solution Ⅱ混匀，于50～53 ℃下水浴振荡2 min洗脱2次。加入200 μL TE于95 ℃下水浴5 min彻底洗脱富集DNA，向上清液中加入22 μL 3 mol·L-1醋酸钠和445 μL预冷的无水乙醇，沉淀DNA。用80%乙醇洗涤，离心烘干后加入20 μL TE溶解。用接头SuperSNX24-F作为引物对富集产物进行PCR扩增回收，PCR反应体系和程序与检测时相同。为增加富集的阳性率，重复以上步骤1次，进行2次富集，用PEG8000法纯化DNA。

1.2.4 克隆与阳性筛选 将纯化后的富集产物克隆到pEGM-T载体中，连接反应在PCR仪上16 ℃过夜，将重组子转入大肠杆菌感受态细胞中培养24 h。每板挑取50～100个白色单菌落，在另一含Amp的LB固体培养基平板上划线，并接种于菌落PCR反应液中，通过菌落PCR（M13F和M13R为引物）筛选出阳性克隆，把划线的平板置于37 ℃培养箱中培养过夜。取3 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测其是否为含有目的片段的阳性菌落。选择PCR检测为阳性的菌落接种至500 μL含Amp的LB液体培养基中，于37 ℃下200 r·min-1振荡培养过夜，将培养菌液送往上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.2.5 序列分析与引物设计 首先，将测序结果导入Geneious 4.8软件中进行检测，使用Trim-ends和Search for the motifs工具去除载体和接头序列，对有叠峰的序列进行反向测序。然后，将经过处理的序列通过Tandem Repeats Finder version 4确定SSR位点，并分析位点的碱基重复序列和重复次数、查看序列长度及微卫星位点两端侧翼序列是否符合引物设计的要求（Benson， 1999）。使用Geneious 4.8内嵌的引物设计功能进行引物设计。所设计引物送于上海生工生物工程有限责任公司合成。

1.2.6 引物稳定性、多态性筛选及评价 为了筛选扩增稳定性好、多态性高的引物和其最佳PCR条件，我们用设计的引物对7个不同地区采集的三叶木通进行PCR扩增，PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

将筛选出的高多态性SSR引物合成5′端荧光标记引物，其荧光基团为FAM（蓝色），HEX（绿色）。选取采集于九江庐山的48个样本进行PCR扩增，送往北京阅微基因有限公司使用ABI3730遗传分析仪进行STR分型，内标均为ROX500。

1.2.7 数据分析 首先，使用Genemapper 4.1软件进行数据统计，通过Micro-Checker 2.2.3检测哑等位基因（Van Oosterhout et al， 2004）。然后，用Genalex 6.5（Peakall & Smouse， 2010） 计算出每个位点的等位基因数（Na）、 有效等位基因数 （effective number of alleles，Ne）、观察杂合度（observed heterozygosity，Ho）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）及哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。最后，使用PowerMaker （Liu & Muse， 2005）计算多态性信息指数（polymorphic information content，PIC）和连锁遗传不平衡（linkage disequilibrium， LD）。所有P值均经Bonferroni法校正。

2 结果与分析

2.1 微卫星富集

选择2个限制性内切酶组合（Rsa I和Xmn I、BstU I和Xmn I）对三叶木通基因组进行酶切，Rsa I和Xmn I的组合酶切后基因组小片段电泳条带弥散，大小分布在100～1 500 bp之间，为后续实验的连接和杂交富集打好基础。BstU I和Xmn I的组合酶切片段较长，片段长度集中在100～200 bp、300～500 bp及大于1 500 bp，这些酶切产物不利于后续磁珠富集操作。本研究用金属浴加热进行漂洗，先在16 ℃下用Washing Solution I漂洗1次；再用Washing Solution Ⅱ分别在45 ℃和50 ℃下漂洗2次，结果富集率太低。然后调整漂洗温度，用Washing Solution Ⅱ分别在46 ℃和51 ℃下漂洗2次，获得所需目的片段，且大大提高了阳性克隆率。

共挑取230个阳性克隆进行PCR检测，大小在300～1 000 bp之间，其中约有40个未扩增出目的片段，部分菌落空载。在190个阳性克隆中挑选出片段长度不同的150个单菌落送往公司测序，148个测序成功。其中，70个含有微卫星序列，富集率为46.67%；可设计引物的序列有57条，占SSR序列的81.43%。57条可设计引物的序列共设计引物63对，其中含双碱基重复单元的序列占SSR序列的79.37%，高于三碱基重复单元的序列占SSR序列的20.63%。

2.2 引物筛选与分析

54对引物扩增产物大小在100～300 bp之间。先用7个DNA样本为模板初次筛选出条带清晰、有多态性的引物33对；再用48个DNA样本为模板进一步对33对引物进行筛选，选出条带清晰、非特异性条带少、多态性较高及扩增效率稳定的引物16对，可以用于SSR位点分析。

48个样品的三叶木通居群中共检测到220个等位基因，每个位点的等位基因数为10～22个，平均等位基因数为15.938个，观察杂合度为0.370～0.792，期望杂合度为0.724～0.936，多态性信息指数为0.725～0.919（均值为0.861），其中12个位点经Bonferroni校正后仍然偏离哈迪-温伯格平衡，呈现纯合子过剩状态，检测到14个位点存在大小不等的哑等位基因频率。发现了3个引物对（MT33-MT45，MT15-MT56和MT35-MT62）存在连锁不平衡（表2）。

3 讨论与结论

随着高通量测序技术的发展，使得SSR位点获得更加低廉、高效，越来越多的研究利用简化基因组测序和转录组测序技术进行高效的微卫星开发（万冬梅等，2016）。在群体遗传和进化研究中需要的微卫星位点数量较少，磁珠富集法可在1周内完成微卫星富集文库构建工作，其高效、快捷的特点更适合少量微卫星引物的开发（王静等， 2015）。在本研究中，因实验室熟练掌握了磁珠富集法，故选用该方法构建三叶木通的微卫星富集文库，在148个成功测序的阳性克隆中获得70个富含微卫星的序列，富集效率较高，达到46.67%。虽然本研究使用了8种不同的探针，包括双碱基重复、三碱基重复和四碱基重复，但富集的微卫星序列主要以双碱基重复为主（79.37%），三碱基和四碱基重复含有量较少。开发的16对引物中仅有2对引物为三碱基重复（MT27，MT33）。这与前人报道的植物中微卫星序列主要以双碱基重复为主一致（Morgante & Olivieri， 1993）。

利用筛选到的16对引物对采自庐山的三叶木通居群进行遗传分析，共扩增出220个多态性条带，发现以上引物的平均等位基因数为15.938个，观察杂合度为0.370～0.792，期望杂合度为0.724～0.936，这与李丽（2010）的研究结果相近。多态性信息指数（PIC）是评估微卫星引物多态性水平的重要参数，普遍认为PIC>0.5为高多态引物，0.25综上所述，本研究开发的16对SSR多态性引物可用于三叶木通遗传分析，进一步补充和完善了木通微卫星分子标记工具，为三叶木通种质资源评价和开发等后续研究打下了坚实基础。

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