粮食中赭曲霉毒素A检测技术的研究

李皖光　张黎利　王新文

[摘要]本研究对粮食中赭曲霉毒素A（OTA）的常用检测方法进行了考察，主要考察了高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和胶体金免疫快速定量检测法（GICT）的检测限（LOD）和定量限（LOQ），通过适用的线性范围和精确度等因素，分析了三種检测方法的优劣，为满足日益变化的检测需求提供了参考。

[关键词]赭曲霉毒素A；高效液相色谱法；酶联免疫吸附测定法；胶体金免疫快速定量检测法

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180811

赭曲霉毒素A（OTA）是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米等）、蔬菜等农作物上的曲霉和青霉产生的。目前，小麦、大麦、玉米等谷类作物中OTA的测定方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）和胶体金免疫快速定量检测法（GICT）。本研究对常用的三种检测方法即HPLC、ELISA和GICT进行了考察，从仪器、人员和时间等多方面论证了三种检测方法的优劣，从最低检出限、定量限、回收率、精密度和重复性等参数分析了三种检测方法的精确度，为日益复杂的检测需求提供了多种选择。

1材料与方法

1.1材料与试剂

小麦粉五个不同梯度的OTA参考物质：美国Charm公司；OTA的GICT试剂盒：美国Charm公司；HPLC免疫亲和柱：北京华安麦科生物技术有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯：上海安谱化学试剂有限公司；OTA的ELISA试剂盒：北京华安麦科生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

高效液相色谱仪（配备荧光检测器，型号为LC-30AD）：岛津（上海）有限公司；MK3酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ROSA-M孵育器和读数仪：美国Charm公司；离心机：盐城凯特实验仪器设备有限公司；旋涡混匀器：德国IKA公司；锤式旋风磨：波通瑞华科学仪器（北京）有限公司。

1.3样品检测方法

HPLC，参照GB/T23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》，结合免疫亲和柱的使用说明；ELISA，参照GB/T 19539-2004《饲料中赭曲霉毒素A的测定》，结合试剂盒生产厂家提供的操作说明；GICT，参照试剂盒生产厂家提供的操作步骤和读数方法。

2结果与分析

2.1线形范围的确立

2.1.1 HPLC的线性范围

小麦赭曲霉毒素A的HPLC与标准值线性关系见图1。以标准物质的标准值作为横坐标，HPLC的检测结果（实测值）为纵坐标，标准物质的标准值为0～61.34μg/kg时，线性回归方程为y=0.9171x+0.4273，相关系数R=0.9999。

2.1.2 ELISA的线性范围

小麦赭曲霉毒素A的ELISA与标准值线性关系见图2。以标准物质的标准值作为横坐标，ELISA的检测结果（实测值）为纵坐标，标准物质的标准值为0～61.34μg/kg时，线性回归方程为y=1.100 9x-0.4716，相关系数R=0.9999。

2.1.3 GICT的线性范围

小麦赭曲霉毒素A的GICT与标准值线性关系见图3。以标准物质的标准值作为横坐标，GICT的检测结果（实测值）为纵坐标，标准物质的标准值为0～61.34μg/kg时，线性回归方程为y=1.033 4x-0.8733，相关系数R=0.9985。

2.2方法测定低限

根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》，用阴性样品连续测定24次后，计算出24次测定的平均值和标准偏差（SD）。再根据检测限（LOD）=平均值+2×SD，计算检测限；定量限（LOQ）=平均值+10×SD，计算定量限。

通过实验测定，三种方法的检测限值均小于1μg/kg，符合检测限要求。综合检测方法所给出的检测限值，HPLC的检测限为0.21μg/kg，ELISA的检测限为0.23μg/kg，GICT的检测限为0.64μg/kg；综合检测方法所给出的定量限值，HPLC的定量限为0.85μg/kg，ELISA的定量限为0.79μg/kg，GICT的检测限为2.88μg/kg。测试数据见表1。

2.3方法精密度

参照GB/T 27404-2008的有关精密度的规定，选择6个参与测试的人员在相同实验室，按照同一方法，采用不同设备，检测相同样品，进行重复性验证。本研究选取了三个水平的标准物质作为待测样品，三种方法的变异系数与标准方法的比较见表2。

2.4方法准确度

参照GB/T 27404-2008的有关准确度的规定，将有证参考物质的标准值作为认定值，三种OTA检测方法的平行测定结果的平均值与之比较，根据正确度=检测值/认定值×100计算。正确度为84.3%～105.5%，平均为97%，符合标准中不同水平的规定，具体结果见表3。

3结论

通过对这三种检测方法的对比研究，可以得出以下结论：三种OTA的检测方法检测限和定量限均小于1μg/kg，精密度和准确度均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的一般要求，可以作为定量的检测方法。

HPLC法需要的试剂较多，需要接触OTA的标准品，使用的免疫亲和柱也需要冷藏保存，需要避免移动色谱仪，便携性不强，实验耗时较长。但是该方法的重复性好、准确度高，因此国家标准中推荐使用此方法。

ELISA法需要的仪器和设备不多，试剂盒需要冷藏保存，接触到的标准品一般浓度较低甚至没有。酶标仪可以携带，一次可以检测大批量的样品，适合于样品的初步筛选。

GCIT法所需要的孵育器和读数仪体积不大，一般不需要接触标准品，具有一定的优势，但是其精确度相比较略差，适用于样品的现场检测和筛选。