第26届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验4·生物化学

佟向军 范六民 刘宝玉 王戎疆 张 立

（1 北京大学生命科学学院 北京 100871 2 天津市第一中学 天津 300051 3 北京师范大学生命科学学院 北京 100875）

总分：100 分

考试时间：90 min

共20 题

考试目的:在本次考试中，将分析酶的动力学和酶的抑制剂。

考试包括2 个主要部分，每个部分包含3 个子部分。

第1 部分（57.5 分）

1.1 酶动力学介绍（理论）（0 分）

1.2 使用合成底物类似物pNP-Gal 的工业α-半乳糖苷酶的酶动力学实验（实验操作）（问题1～2：40 分）

1.3 α-半乳糖苷酶的酶动力学数据分析（问题4～11：17.5 分）

第2 部分（42.5 分）

2.1 酶抑制剂介绍（理论）（问题11～13：2 分）

2.2 α-半乳糖苷酶的抑制实验（实验操作）（问题14：27 分）

2.3 α-半乳糖苷酶的抑制动力学数据分析（问题15～20：13.5 分）

在考试开始之前，建议首先浏览整个试卷以了解大致内容。由于大多数分数设置在实验部分，所以建议在开始计算和回答理论问题之前（第1.3、2.1 和2.3 部分）首先完成1.2 和2.2 部分。

材料与设备

为了完成实验工作，需要下面列出的材料。请确保可以获取这些材料。如果发现材料缺失，请在考试开始15 min 之内举手示意考务人员。

A.1 个p200 移液器。使用移液器p200 转移体积为20～200 μL 的液体，除非另有说明。

B.1 个p1000 移液器。使用移液器p1000 转移体积为200～1 000 μL，除非另有说明。

C.p200 移液器的96 孔吸头盒。 除非另有说明，否则每次移液后应丢弃移液器吸头。

D.p1000 移液器的96 孔吸头盒。 除非另有说明，否则每次吸液后应丢弃移液管吸头。

E.＞30 个微量离心管（1.5 mL）

F.1 个微量离心管支架

G.2 个标有国家代码+A 或B 的微量滴定盘

H.1 个微量滴定板模板

I.1 只秒表

J.1 支铅笔

K.1 支记号笔

L.1 个计算器

M.1 把直尺

N.1 张用于示意考务人员的粉红卡片

O.9 mL 2 mol/L Na2CO3（终止液）

P.6.5 mL 15 mmol/L pNP-Gal（底物）

Q.15 mL 超纯水

R.5 mL 1 mmol/L pNP（标准溶液）

S.2 mL 0.024 mg/mL（酶）

T.5 mL 0.5 mol/L（抑制剂）

U.平板电脑触控笔

第1 部分

1.1 酶动力学简介

α-半乳糖苷酶可以催化α-半乳糖苷中末端半乳糖残基的水解。通常，使用合成底物类似物对硝基苯基-α-半乳糖苷（pNP-Gal）测定α-半乳糖苷酶的活性，α-半乳糖苷被水解成半乳糖（Gal）和对硝基苯基（pNP）（图1）。

pNP-Gal 是无色的，而pNP 产物为黄色并且其浓度可以通过微量滴定板读数器确定405 nm处的吸光度。

图1 半乳糖苷酶活性测定示意图

在第1 部分中，将对水解速率对底物浓度的依赖性进行研究。为了达到这一目的，描述这种关系的Michaelis-Menten 图（图2）可用于估计2 个重要参数Vmax和Km（参见图2 的图例）。 初始反应速率Vo 可以由Δ［P］／Δt 确定，该值是单位时间内（Δt）的产物浓度（［P］）的变化。

图2 Michaelis-Menten 图

Lineweaver-Burk 图中的参数Vmax 和Km 可以分别从Y 轴和X 轴截距确定（图3）。 通过绘制初始反应速率（1／Vo）与底物浓度（1／［S］）的倒数的方法可以产生Lineweaver-Burk 图。

图3 Lineweaver-Burk 图

1.2 工业α-半乳糖苷酶的酶动力学实验

1.2.1 标准曲线 首先产生用于测量酶反应产物浓度（pNP）的标准曲线。 要产生标准曲线，你需要用终止液（Stop）稀释1 mmol/L pNP 标准储备溶液（Standard）。

问题1.标准曲线稀释方案。

当需要使用时，要用终止液(Stop)稀释1 mmol/L pNP标准储备溶液（Standard）。 计算在500 μL 总体积中制备最终标准浓度所需的pNP 和终止液的体积。 在表1 中填入你的计算值。

表1 稀释方案制备标准曲线

绘制标准曲线的步骤：

A.用记号笔标记上表第1 行中5 个1.5 mL 微量离心管（St1～St5）。

B. 将不同体积的1 mmol/L pNP 标准储备溶液（Standard）转移到标记的1.5 mL 管中（使用相同的吸头）。

C.根据上表中的计算，将不同体积的终止液（Stop） 转移到标记的管中。 将微量离心管倒置5次，使其与标准溶液彻底混合。

D.将100 μL 超纯水（Water）转移到微量滴定板A 的A1～A5 和B1～B5 孔中（使用相同的吸头，参见图4 和/或使用微量滴定板模板帮助你移液到正确的孔中） 。

E.转移50 μL 上述最终溶液到相同的微量滴定板孔中。 每种溶液被分别转移到2 个不同的孔中（下标I 和II，图4）。

F.使用p1000 移液器向每个pNP 标准A1～A5和B1～B5 孔中添加100 μL 终止液（Stop）。通过将混合物上下颠倒2 次彻底混合。

图4 微量滴定板A

现在继续进行第1.2.2 部分，将酶反应混合物置于你的微量滴定板上。

重要提示：考务人员在考试的最后10 min 内将不再接收任何微量滴定板。 如果你感觉无法及时完成1.2.2 的部分，请通过举起粉红卡片告知考务人员。 你的操作结果将显示在问题2 中。

1.2.2 酶动力学实验

步骤：

准备pNP-Gal 底物稀释溶液进行动力学实验。

A.标记5 个1.5 mL 管，标记为S1 至S5（表2）。B.将15 mmol/L pNP-Gal 底物储备溶液（Substrate）用标准1.5 mL 管中的超纯水（Water）进行稀释（表2）。 稀释溶液应通过将管颠倒倒置5 次彻底混合。

表2 酶动力学测定的底物稀释方案

C.将50 μL 每种稀释的底物溶液（表2）和50 μL 超纯水（Water）转移到微量滴定板A G1～G5 和H1～H5。（参见图4 和/或微量滴定板模板）。

D.将定时器设置为5 min，并在将酶溶液移至第1 孔后立即开始计时，以开始第1 次酶促反应（SI1），如下所述。

E.移取50 μL 0.024 mg/mLα-半乳糖苷酶（Enzyme），从SI1 和SII1 开始加入G1～G5 和H1～H5 孔，并继续以相同的顺序和间隔持续到SII5 以开始每个孔中的酶反应（以下称为“酶反应混合物”）。为确保良好的混合，快速但轻柔地将50 μL 的混合物在每个孔中进行上、下2 次移液。

F.孵育5 min 后，使用p1000 移液管加入100 μL 2 mol/L Na2CO3溶液 （Stop），以与你开始的步骤相同的顺序和速度终止孔G1～G5 和H1～H5 中的每个酶反应。通过将混合物上、下移动2 次混匀。

问题2.酶动力学实验。

举起粉红色卡片上交你的的微量滴定板。 测量后，所得值将自动显示在表3 中。

注意：在考试的最后10 min 内不会接受微量滴定板。

表3

1.3 酶动力学的数据分析

现在，你的任务是通过α-半乳糖苷酶测定底物水解的动力学参数。

首先，使用表4 中的数据确定产物（pNP）的标准曲线线性函数。 使用标准曲线可以计算反应混合物中的产物浓度，进一步可以通过确定初始反应速率（V0）计算每个底物浓度。

表4 用于模拟微量滴定板A 的标准数据，这样可以避免1.2 部分的错误。 在实际情况下，使用你自己的数据进行计算。

表4 用于计算的吸光度数据（微量滴定板的第1～5 列）

问题3.标准平均吸光度。

计算表5 中给出的标准曲线的每个重复测量的平均吸光度。 输入小数点后3 位数。

表5 标准曲线的平均吸光度

问题4.标准曲线线性函数。

在图5 中，将pNP 的浓度（mmol/L）对应于吸光度（问题3 中计算出的平均A405nm）作图。

图5 估测pNP 产品标准曲线

在数学上仅使用2 个数据点St1 和St5 的平均吸光度确定标准曲线线性函数（见下文）的a 和b。 为a 和b 给出小数点的后3 位。

A405（405 nm 处的吸光度单位）=a·［pNP］（mmol/L）+b，其中a 是斜率，b 是Y 轴截距。

来自实验部分1.2.2 的酶反应混合物的体积为150 μL。

问题5.反应时间。

将步骤中给出的反应时间单位设置为s。

问题6.动力学数据分析（无抑制剂）。

使用以下标准曲线方程式计算每种反应混合物的产物浓度：

A405吸光度=2.29×［pNP］（mmol/L）+0.058。

初始反应速率V0可以从Δ［Product］／Δ 时间确定，即单位时间内产品浓度的变化。所有数字保留到小数点后3 位。

表6 分析数据

问题7.Michaelis-Menten 参数（图形估计）。

图6 Michaelis-Menten 图

从Michaelis-Menten 图以图形方式估算Vmax和Km(图6)。在小数点后给出1 位有效数字的答案。

问题8.Lineweaver-Burk 线性函数。

图7 是表3 中S1～S5 数据点的Lineweaver-Burk 图（1／V0对1／［S］）。

图7 Lineweaver-Burk 图

确定Lineweaver-Burk 图中线性函数（图7），给出S1 和S5 2 个数据点小数点后的3 位有效数字，即a 和b。

1／［Vo］＝a×1／［S］+b

问题9.测定Vmax 和Km。

使用上面计算的线性函数（问题8）确定Vmax和Km。给出小数点后3 位数（不应进行单位转换）。

问题10.反应混合物中的酶浓度。

用酶储液浓度0.024 mg/mL 和酶的摩尔质量（75000 g/mol）计算反应混合物中的酶浓度(μmol/L)。给出小数点后3 位数。

问题11.转化率常数。

催化速度常数kcat（1 个酶分子的反应速率）单位为1/s，计算公式如下：

计算出催化速度常数kcat，保留小数点后3 位。

2.1 抑制剂简介

抑制剂是可以特异性结合酶的化合物，从而降低其活性并导致Km、Vmax 或两者的明显变化。 表观动力学参数的变化可以从在抑制剂存在下进行的酶反应的Lineweaver-Burk 图确定。 取决于与酶结合的方式，可逆抑制剂可以是竞争性的，非竞争性的或无竞争性的。

酶活性的抑制和动力学参数的明显变化也可以在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 图中显现（图8）。

图8 在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 图中的抑制酶活性

抑制剂的特征在于其抑制平衡常数Ki，其定义为

其中［I］、［E］和［EI］分别是游离抑制性剂，游离酶和酶抑制剂复合物的浓度。对于竞争性抑制，在抑制剂存在下的表观Km 被指定为Ki。 底物

图9

问题12.影响抑制剂的因素。

对于所有抑制类型，其抑制程度（即酶反应速率的降低）取决于（选择下面最好的答案）：

1）抑制浓度［I］2）底物浓度［S］

3）抑制剂的Ki4）［ES］的浓度

5）1，2 和3 的状态6）1 和3 状态

问题13.理解抑制剂的特性。

标示出以下语句的正确或错误：

在竞争性抑制中，底物浓度［S］的增加会降低或克服抑制效果。

2.2 对α-半乳糖苷酶的抑制作用（27 分）

这部分实验类似于第1 b 部分。 α-半乳糖苷酶的抑制动力学实验将在50 μL 抑制剂的存在下进行，其浓度为0.5 mol/L。

步骤：抑制动力学实验底物制备。

A.根据表7 准备底物，这与你在第1.2.2 部分中所做的相似。注意应通过将试管倒置5 次混合溶液。

表7 用于动力学测定的底物稀释方案

B.使用相同的移液管吸头将50 μL 抑制剂（I抑制剂）转移到微量滴定板B 孔A1～A5 和B1～B5中（见图10 和/或微量滴定板模板）。

C.将50 μL 每种最终底物溶液（表7）转移到相同的孔位置（A1～A5 和B1～B5）。

图10 微量滴定板B

D.将定时器设置为5 min，并在开始第1 次酶反应后立即通过将酶溶液加入到第1 孔（ISI1）中开始，如下所述。

E.从ISI1 和ISII1 开始，将50 μL 的α-半乳糖苷酶（EEnzyme）加入孔A1～A5 和B1～B5，并继续以与ISII5 相同的顺序和速度开始酶反应。

F. 孵育5 min 后，使用p200 移液器加入100 μL 终止液（Stop），按照你开始加入时的相同顺序和速度终止孔A1～A5 和B1～B5 中的每个酶反应。 在加入终止液后，立即将混合物上下移动2次，彻底混匀。

问题14.酶抑制剂动力学实验。

举起粉红色卡片上交你的的微量滴定板。 测量后，所得值将自动显示在表格（同表3）中。

注意：在考试的最后10 min 内不会接受微量滴定板。

2.3 α-半乳糖苷酶抑制动力学的数据分析

在本节中，你将利用第2.1 部分的理论和第2.2 部分提供的抑制数据（表8）计算抑制剂存在下的酶动力学参数。 用于抑制数据的Lineweaver-Burk 方程将与提供的假设的Lineweaver-Burk 方程进行比较，用于推导各种抑制类型和不受抑制的反应。当你确定抑制类型时，请使用这2 个方程式来确定相关动力学参数的变化，并使用相关方程来确定抑制平衡常数（Ki）。

表8 抑制实验的吸光度数据

问题15.抑制动力学数据分析。

计算并填写表9。 为了以mmol/L 计算产物浓度，请使用问题6 给出的标准方程式：

吸光度A405=2.29×[pNP]（mmol/L）+0.058。

表9

依据上表中抑制动力学数据IS1～IS5，产生Lineweaver-Burk 图。

假设不受抑制的反应的Lineweaver-Burk 方程为：1／［Vo］=0.363·1／［S］+0.9908，将该线绘制在图11 中。 请用此方程用于下面的计算，而不是你在1.3 部分中确定的方程式（图7）。

图11 假设的非抑制性数据的Lineweaver-Burk 图

问题16.线性函数（抑制反应）。

在存在抑制剂的情况下确定Lineweaver-Burk图的线性函数（图11），在数学上仅使用来自IS1和IS5 的数据。 a 和b 给出小数点后3 位。

1／［Vo］=a·1／［S］+b。

问题17.表观动力学参数与抑制剂。

在抑制反应的Lineweaver-Burk 图中确定存在抑制剂的表观动力学参数。 给出小数点后3 位数（不需要进行单位转换）。

问题18.确定抑制类型。

抑制剂对α-半乳糖苷酶有什么抑制作用？ 与抑制酶的假设数据相比，基于抑制剂存在的动力学参数变化的大小，选择最可能的抑制类型：

1）竞争性2）非竞争性3）不确定

问题19.底物浓度的影响。

根据你以上选择的抑制类型，底物浓度的增加如何影响抑制？ 选择出正确答案：

1）抑制减弱2）无变化3）抑制增强

问题20.抑制常数。

如果添加到反应混合物中的50 μL 抑制剂的浓度为0.5 mol/L，则确定抑制常数（Ki）。 在小数点保留3 位数字（在此计算中不进行单位转换）。

考试结束。

（第26 届试题完）