上海市150株猪链球菌对8种常见抗菌药物的耐药情况

王晓旭，宁 昆，徐 锋，沈莉萍，张维谊

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪链球菌不但能引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎和淋巴结肿胀，还能通过特定的传播途径传染给人，是一种重要的人兽共患传染病病原。随着现代化养殖技术的推广与发展，我国集约化养猪规模不断扩大，猪链球菌病的发生呈现上升趋势，并常常与猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒病等发生混合感染。因此，猪链球菌病一直是养殖业重点关注的细菌性病害之一，给我国养殖业带来了严重经济损失。在实际生产过程中，抗菌药物的不合理使用导致猪链球菌对许多临床常见抗菌药物产生了耐药性，且多重耐药情况日益加剧[1-2]。为了解上海市猪链球菌耐药情况，选取5类8种临床常用抗菌药物，对2004—2017年从上海市分离的150株猪链球菌开展体外最小抑菌浓度（MIC）药物敏感试验，以期为本地区猪链球菌病防控及临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株及参考菌株 本试验所取的150株供试菌株为2004—2017年上海市动物疫病预防控制中心分离鉴定并保存的，具体分离年代与数量见图1。根据美国临床验证标准委员会（CLSI）推荐，选取肺炎链球菌ATCC 49619作为药敏试验质控菌株。

图1 150株供试菌株分离年代与数量分布

1.1.2 主要试剂及引物 哥伦比亚基础培养基：购自北京路桥技术有限公司；无菌脱纤维羊血：购自上海诸翟无菌动物血供应站；革兰氏染液：购自珠海贝索生物技术有限公司；猪链球菌鉴定引物：参考文献[3]设计，由上海桑尼科技有限公司合成。

1.1.3 抗生素及药敏板 5类8种抗菌药物：β-内酰胺类的青霉素、氨苄西林、头孢噻呋，喹诺酮类的环丙沙星、氧氟沙星，四环素类的四环素，酰胺醇类的氟苯尼考和大环内酯类的红霉素。配套肉汤稀释液：按要求添加溶解马血（Lysed horse blood，LHB）；药敏板及肉汤稀释液：购自天津金章科技发展有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 PCR仪（PTC-200）：Biorad公司生产；CO2培养箱（Model 371）：Thermo公司生产。

1.2 方法

1.2.1 猪链球菌的分离与鉴定 将临床发病样本或日常监测样本，无菌接种哥伦比亚血琼脂培养基，置于5% CO2恒温培养箱中，36 ℃培养1～2 d；挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检；按初次分离培养条件进行纯培养。刮取纯培养细菌，采用热裂解法提取细菌核酸，采用16S-gdh双重PCR鉴定方法进行鉴定。PCR反应体系为25 μL：2×premix 12.5 μL，两对引物上下游各 0.5 μL，DNA模板2 μL，灭菌蒸馏水8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，扩增30个循环；72 ℃延伸10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后成像并拍照。对PCR阳性样本进行纯化和保存。

1.2.2 MIC药敏试验

1.2.2.1 制备菌液 使用无菌棉签蘸取适量纯培养的新鲜待测菌，悬浮于3 mL无菌生理盐水中；用比浊仪调整菌液浓度，使其麦氏单位达到0.5±0.02，即菌液浓度达到1×108CFU/mL。对质控菌株采取相同制备方法。制备的菌悬液现制现用，不宜长时间摆放。

1.2.2.2 接种菌液 从12 mL稀释肉汤中吸取100 μL加入药敏板空白对照孔。取12 μL待测菌液至肉汤稀释管中（即最终接种浓度为1×105CFU/mL），充分混匀后加入96孔药敏板中，每孔100 μL，同时加入无药空白孔作为生长对照。

1.2.2.3 孵育培养 将药敏板置于5% CO2培养箱中，36 ℃ 培养16～18 h。培养箱中加入适量灭菌蒸馏水，以保持一定湿度。

1.2.2.4 读取结果 在衬有黑色底板的光线下，用肉眼观察。孔底呈散状混浊或小孔底部有圆形沉淀，即判为有细菌生长；空白对照孔中不出现混浊或沉淀，且生长对照孔出现混浊或沉淀时，该板结果为有效结果；如果两孔对照均不成立，或某一对照孔结果不成立，则均判为无效结果；当对照孔均成立时，孔内不出现混浊和沉淀的无细菌生长孔内所含的最低抗菌药物浓度，即记作最低抑菌浓度。每批次药敏试验均需设质控菌株为参考组，且只有当质控菌株的药敏结果在CLSI规定的范围内时，该批次结果才予以采纳。

2 结果与分析

2.1 8种药物的体外抗菌活性

150株猪链球菌中，95%的细菌对8种抗菌药物产生了不同程度的耐药，耐药率为16.67%～90.00%（ 表 1）。 其 中， 对 β-内 酰 胺类药物的耐药性较低，耐药率分别为氨苄西林16.67%、青霉素19.33%、头孢噻呋26.00%；对酰胺醇类和喹诺酮类药物出现了一定程度的耐药，对氟苯尼考的耐药率为24.67%，对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率均为42.00%；对大环内酯类和四环素类药物则出现了极高的耐药性，对红霉素、四环素的耐药率分别达到82.67%、90.00%。

2.2 菌株的多重耐药性及耐药谱

表1 不同药物对猪链球菌的体外最小抑菌浓度（MIC）及耐药菌株数

根据药敏试验结果，测试菌株的2重耐药所占比重最大，为51%；46%的菌株表现出3重及以上的多重耐药，其中10.7%的菌株表现为8重耐药（图2）。

通过各菌株对8种药物的耐药情况，分析获得了27种耐药谱型（表2）。

2.3 不同年代分离菌株耐药情况

图2 150株猪链球菌耐药情况分布

表2 猪链球菌耐药谱型

对不同分离年代菌株的耐药性进行统计发现，2012年前，仅少数年份分离的少数菌株对β-内酰胺类药物表现为耐药，但从2013年后，每年都有耐药菌株出现，且耐药率整体呈加重趋势。对四环素（TET）、红霉素（ERY）等药物，多数菌株很早就已表现为高度耐药。整体来看，分离菌株对所有药物的耐药性呈加重趋势。150株供试菌株的分离年代及耐药情况见表3。

表3 不同年代菌株对不同药物耐药率统计

2.4 青霉素敏感株与耐药株交叉耐药情况

青霉素敏感株与耐药株对氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、四环素、氟苯尼考、红霉素、头孢噻呋的交叉耐药率测定结果见表4。结果表明，青霉素耐药菌对氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、头孢噻呋的耐药率明显高于青霉素敏感菌。

表4 猪链球菌青霉素敏感株与耐药株的交叉耐药分析

3 讨论

猪链球菌病的防治主要通过注射疫苗，以及应用青霉素类、头孢类、氨基糖普类、林可胺类、大环内酯类和哇诺酮类等抗菌药物[4]。但由于猪链球菌血清型多达35种[5]，况且近些年亦有报道发现更多的血清型[6]，从而对疫苗使用形成了一定制约，使得猪链球菌病防治的首选方案仍旧为使用抗菌药物。然而抗菌药物的滥用，导致动物体内耐药菌株大量出现。

本研究显示，上海市150株猪链球菌对8种常见抗菌药物的耐药率在16.67%～96.67%之间：对β-内酰胺类药物的耐药率为16.67%～26.00%，对酰胺醇类、喹诺酮类药物耐药率为24.67%～42.00%，对大环内酯类和四环素类药物的耐药率达到了82.67%～90.00%。从获得的27种耐药谱看：2重耐药情况最为普遍，有51株（34%），其中48株为红霉素、四环素耐药；多重耐药情况较为严重：3重耐药菌株6株（4.0%），4～7重耐药47株（31.3%），8重耐药16株（10.7%）。

该研究结果与全国其他地区的耐药情况基本相似。2004年杨建江等[7]发现从长春市分离的猪链球菌对青霉素和氨苄西林敏感，而80%菌株对四环素、红霉素、环丙沙星耐药；2006年应芳薇等[8]对浙江省分离的38株猪链球菌进行药敏试验，发现大部分菌株对青霉素类和头孢类药物敏感，而对四环素类、林可酰胺类药物耐药，且存在多重耐药；2009年张纯萍等[9]研究发现，全国10个省市健康母猪体内分离到的猪链球菌对氨苄西林、青霉素和头孢噻呋敏感性较高，而对四环素和磺胺甲基异噁唑高度耐药。焦安心等[10]对安徽省112株猪链球菌开展20多种药物的药敏试验发现：测试菌株对四环素、链霉素、强力霉素、庆大霉素等耐药率较高，均超过85%，而仅对氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定等药物相对敏感，且多重耐药情况严重，8重及以上耐药率高达85.7%。王巍等[11]对四川省34株猪链球菌开展18种常用抗菌药物的药敏试验，发现测试菌株对四环素100%耐药，对大环内酯类、磺胺甲噁唑的耐药率均高于85%，只对阿莫西林、氨苄西林稍敏感，且5重及以上耐药比率高达94.1%，多重耐药情况普遍。Zhang等[12]从全国不同地区分离的96株猪链球菌进行药敏试验，发现分离株对四环素耐药最严重，其次是对红霉素、克林霉素和替米考星。

自1942年应用于临床以来，青霉素在很长一段时间内是治疗链球菌属的廉价而敏感的药物，直到1974年，美国首次报到了对青霉素不敏感的肺炎链球菌脑膜炎株[13]。时至今日，青霉素出现了越来越多的耐药株，耐药率持续攀升。为此，CLSI于2008年发布了新的耐药标准，调整了青霉素对部分链球菌属的耐药MIC折点值[14]。但从目前各类药物的体外药敏试验结果来看，青霉素仍旧是临床上相对敏感的药物，与其同属β-内酰胺类的氨苄西林、头孢噻呋敏感性也较好。但结合各年份的耐药情况看来，猪链球菌对β内酰胺类药物的耐药性也表现缓慢上升趋势，需引起重视。

从本研究统计结果看，青霉素耐药菌对氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、头孢噻呋的耐药率明显高于青霉素敏感菌。这与国内外一些研究报道的结果基本一致[15-17]，提示在临床治疗过程中，如出现对青霉素耐药猪链球菌感染引起的疾病，采用其他药物进行治疗，效果也不会理想。

4 结论

本研究对上海市分离的150株猪链球菌开展8种常用药物的体外最小抑菌浓度药物敏感试验，发现95%的猪链球菌对其产生了不同程度的耐药，其中对β-内酰胺类药物耐药率最低，其次为酰胺醇类药物氟苯尼考、喹诺酮类药物环丙沙星和氧氟沙星，而对大环内酯类和四环素类药物的耐药率均高于80%。此外，猪链球菌多重耐药情况严重，且耐药性整体呈缓慢上升趋势。本研究结果提示，本地区猪链球菌耐药情况较为严重，且多重耐药情况普遍。

虽然抗菌药物为人类以及畜禽疾病的防治作出了突出贡献，但伴随着细菌耐药问题的日益严峻，注重对基层养殖场户的技术指导，规范临床抗菌药物使用，加强对细菌耐药性的监测，鼓励临床耐药机制的探索与研究，创新抗菌药物种类，才是解决问题的根本之道，亦是在新的时代背景下建立和发展上海市城市农业、精品农业的必然选择。