90份广西桑树种质资源的染色体倍性鉴定

黎月娟 邱长玉 林 强 崔秋英 朱光书 张朝华 吴 凡 朱方容

(1广西大学农学院， 广西南宁 530004； 2广西壮族自治区蚕业技术推广总站， 广西南宁 530007)

桑树(MorusL.)是多年生落叶木本植物，长期以来桑叶主要作为家蚕的饲料，桑椹(桑果)主要用来制作桑椹汁、桑椹酒、桑椹果酱等[1]。为能更好地发展蚕桑产业，需要培育优良的桑树新品种，因此了解桑树的染色体倍性极其重要。经过国内外学者的长期研究证明，桑属植物中绝大部分为自然二倍体，但也存在多种自然多倍体[2]。经前人的统计发现，中国桑树有天然三倍体64份、四倍体13份、六倍体66份、八倍体2份、二十二倍体1份[3]，是桑树多倍体种质资源最丰富的国家。

桑树多倍体表现出一些特殊性状，如四倍体与其亲本二倍体相比，在外形上明显表现出叶片增大、叶肉增厚、叶色加深、叶脉粗，枝条数少，长得矮壮等特征[4]。鉴于桑树多倍体的优势，为了选育既高产桑叶，又高产桑椹的新型品种，王茜龄等[5]培育成果叶兼用人工多倍体桑树新品种嘉陵30号，该品种是中国第一个通过审定的果叶兼用人工多倍体桑树新品种[6]。育种专家还育成了多倍体杂交组合粤桑11号[7]、粤桑51号[8]、桂桑5号[9]和特优2号[10]等优良桑树品种。在研究桑树多倍体的时候，发现了桑树混倍体现象，何大彦等[11]在观察桑树染色体倍性时发现，在六倍体桑树品种旺苍11号、贵州31号内有四倍体细胞，在四倍体桑树品种芦山3号内有二倍体细胞。如果利用染色体计数的方法来计算混倍体中各个染色体倍性细胞所占的比例极其困难，但是流式细胞术的出现可以解决该问题。流式细胞术是一种快速、简单、能准确地检测植物染色体倍性的方法[12]，其原理是用染色剂对细胞进行染色，上机检测，根据荧光密度与DNA含量成正比，以得到的峰值图直接反映出不同染色体倍性细胞所占的比例。本次试验主要利用流式细胞仪对广西壮族自治区蚕业技术推广总站桑树种质资源圃的90份桑树种质资源进行染色体倍性测定，鉴定出二倍体种质资源32份、三倍体种质资源18份、四倍体种质资源30份和混倍体种质资源10份，以期为桑树的多倍体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 桑树种质资源 试验的所有桑树种质资源均来自广西壮族自治区蚕业技术推广总站桑树种质资源圃。采样时间为早上8：00—9：00，采样部位为相同品种的单株不同枝条或不同单株的刚刚展开的嫩叶(采样的不同主要根据品种嫩叶量的多少来决定)，每个品种3个重复，每个重复称取0.25 g材料。对照样品为二倍体沙2×伦109。

1.1.2 主要试剂 氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)，均为分析纯，天津市博迪化工股份有限公司产品；羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，规格为100 g，天根生化科技有限公司产品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品； 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，规格为500 mL，索莱宝生物科技有限公司产品；Guava·Cell Cycle Reagent染色剂，规格为25 mL，美国EMD Millipore corporation公司产品；RNaseA酶，浓度为10 mg/mL，索莱宝生物科技有限公司产品。

1.1.3 检测仪器 流式细胞仪，型号为MP-Guava easyCyte HT-2，美国EMD Millipore corporation公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 MgSO4解离液的配制 以配制1 000.0 mL的MgSO4解离液的量进行配制，先在烧杯中装入800.0 mL超纯水，然后依次加入3.70 g的氯化钾、2.46 g的硫酸镁、1.19 g的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、10.00 g的聚乙烯吡咯烷酮和2.5 mL的聚乙二醇辛基苯基醚，搅拌溶解，用超纯水定容至1 000.0 mL，最后用NaOH溶液调节pH至7.5。

1.2.2 90份广西桑树种质资源染色体的倍性鉴定 参考文献[13]的方法，称取0.25 g的新鲜样品置于平面玻璃板上，加入预冷的1.0 mL MgSO4解离液，用锋利的刀片快速切碎，转移至预冷培养皿中并混匀，然后于冰上静置大约5 min，用300目细胞筛网过滤至1.5 mL的EP管中，4 ℃下1 000 r/min 离心4 min，离心漂洗 1次，得到0.5 mL左右的单细胞核悬浮液，然后加入RNaseA酶至最终体积质量浓度为 30 μg/mL，然后加入100 μL的染色剂，避光染色30 min，以上操作均在冰上进行。染色完成后用300目细胞筛网过滤，上样至96孔板，用MP-Guava easyCyte HT-2型流式细胞仪进行检测，调节所需参数，每个样品收集分析10 000 个细胞核，分析数据，横坐标表示细胞核DNA 相对含量的荧光强度(RED-A)，纵坐标为细胞核数量(Count)。以桑树二倍体品种沙2×伦109作为对照，将待测样品与之比较，根据它们之间的关系，得出相应的桑树染色体倍数。每个样品设置3组重复。利用Flowjo7.6软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 对照组染色体的倍性测定

以沙2×伦109作为对照组，检测调试电压时把沙2×伦109的峰值调到2 000道的位置，如图1所示，细胞染色体的倍性与细胞核DNA含量呈现一种正比例的关系，而细胞核的DNA含量又与荧光强度成正比；因此，未知待测样品根据对照组的峰值进行判断，根据倍性关系即可得出待测样品染色体的倍性。每做一批样本试验都要用对照组进行调试，以减少偏锋现象的出现，减少误差。

图1 桑树品种沙2×伦109染色体倍性的流式细胞仪检测直方图

2.2 鉴定组染色体的倍性测定

通过对未知样品的检测，根据对照组的峰值对未知样品检测的峰值进行染色体倍性鉴定。下面以92L-17、2182和92L-49等3个桑树种质资源为代表进行具体分析说明，其他桑树种质资源的分析同理。如图2所示，根据与对照组的比较，92L-17、2182和92L-49的峰值分别在2 000、3 000和4 000道的位置，由此可判定92L-17、2182和92L-49分别为二倍体、三倍体和四倍体。本次共检测90份不同的桑树种质资源，通过数据分析，如表1、表2所示，二倍体种质资源32份，三倍体种质资源18份，四倍体种质资源30份，混倍体种质资源10份。混倍体中不同染色体倍性细胞所占的比例可以通过软件自动分析生成得出具体比例，分析方法如下：首先根据公式计算未知样品的G1的平均峰值的比值，即未知样品的G1的平均峰值的比值=未知样品的G1的平均峰值/参考标准的G1的平均峰值，然后根据未知样品的G1的平均峰值的比值得出染色体倍性。如图3所示，90-126有2个尖峰出现，其峰值分别在1 500和2 750道的位置，分别为对照组的0.75和1.38倍，符合二倍体和三倍体的特征，由此推断90-126为二倍体和三倍体的混倍体，其中二倍体细胞占43.2%，三倍体细胞占56.8%。同理，92L-20也有2个尖峰，其峰值分别在2 000和3 600道的位置，分别为对照组的1.00和1.80倍，符合二倍体和四倍体的特征，因此92L-20为二倍体和四倍体的混倍体，其中二倍体细胞占25.9%，四倍体细胞占74.1%。在10份混倍体种质资源中有6份为二倍体和三倍体的混倍体，4份为二倍体和四倍体的混合体，具体如表2所示。

图2 桑树种质资源92L-17、2182和92L-49染色体倍性的流式细胞仪检测直方图

表1 80份桑树种质资源染色体倍性鉴定结果

表2 10份桑树种质资源染色体倍性鉴定结果

图3 混倍体桑树种质资源90-126和92L-20染色体倍性的流式细胞仪检测直方图

3 小结与讨论

利用流式细胞仪对桑树染色体的倍性进行检测，该检测方法简便、高效，并且可从较大的细胞群体中检测出不同染色体倍性细胞的比率，从而可以准确地判断该植株是否是混倍体。由于桑树是异花受粉植物，在自然条件下，天然混倍体是比较普遍的；而且，混倍体还可通过属间嫁接诱发、化学药剂诱发、有性杂交等途径产生[14]。如鲁诱1号就是通过人工诱导产生的混倍体桑树品种，该品种不仅具有四倍体叶质优、叶片大、叶肉厚的特点，还具有亲本二倍体生长势旺的特点[15]。在冬枣植物中也发现了混倍体的存在，并且对其各方面进行调查与评价，发现某些性状也较好，如单果质量更大[16]。菜用枸杞新品种天精3号也是人工选育的混倍体品种，是对瘿螨免疫、高抗白粉病和根腐病、营养品质和药用品质优异的品种[17]。由此可知，混倍体具有某些特有的优势，应加以利用。早在1952年关博夫就发现混倍体现象，但直到2013年韩莎等才利用流式细胞仪对混倍体进行了检测，并得到混倍体细胞所占比率的实验证据[18]。混倍体植株不但含有2种不同染色体倍数的细胞，还可能含有3种或多种不同染色体倍数的细胞[14]。对于混倍体，可以加以利用，如通过不断的分离得到优势个体。

运用流式细胞仪检测桑树染色体的倍性时有报道，但其总体检测的数量不多，有的是桑树诱导后，利用流式细胞仪检测诱导后的染色体倍性[19]，有的是对解离液的选择和操作过程进行探究[13]，还有的是运用流式细胞仪检测对桑树的取材方面影响的分析[18]。而本次试验主要是根据前人的研究，利用流式细胞仪对广西保存的桑树种质资源进行检测，其检测数量较多，并且发现了部分混倍体，这对桑树种质资源的保存与利用意义重大。

本次试验在检测的90份桑树种质资源中就发现10份混倍体，该结果跟桑树混倍体普遍存在符合[14]，并分析了混倍体所含的不同染色体倍数细胞所占的比率。但本次试验表2中的桑树种质资源所检测的倍性有小部分与广西壮族自治区蚕业技术推广总站的专家以前所鉴定的倍性有所不同(未发表)，分析其原因可能是这些品种是由二倍体诱导育成四倍体，育成的植株可能含有二倍体和四倍体细胞，并且本次检测距离以前的检测已隔5年之久，加上多年的剪伐和环境因素的变化，这些都有可能导致其染色体倍性发生变化，但其具体原因还需要进一步探究。多倍体育种也是桑树选育的一种手段，一般四倍体作为育种素材和二倍体培育三倍体，如三倍体湘桑6号就是利用四倍体作为育种素材和二倍体培育而成的[20]。多倍体不但在生产上表现出“多倍体效应”，而且某些多倍体具有较强的抗逆性[21]，因此染色体倍性的鉴定显得极其重要。通过多倍体诱导，杂交组合等手段对多倍体进行育种，可以选育出不同用途的桑树品种，如选择抗性强的桑树品种应用在生态景观方面，选择桑叶丰产优质的桑树品种应用在家蚕的饲养上，选择桑椹丰产优质的桑树品种应用在食品中，选择桑叶营养丰富口感好的桑树品种应用在蔬菜行业等，丰富桑树种质资源，提高桑树多倍体的应用范围。