含油废水中筛选的两种石油降解菌的鉴定及降解效果

刘 虹，高鹏飞，丛唯一，王明超，温 钢，田 朕

(1.吉林化工学院 资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022；2.吉林省环境科学研究院，吉林 长春 130012；3.吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林 132022)

当今，石油对土壤、水和其他自然资源的泄漏备受关注，石油污染对人类和生态系统来说是一个严重而且日益严重的问题.为了解决这一环境问题，应用适当的微生物技术是对有害污染物生物降解的最佳途径之一，微生物技术即利用微生物的代谢活动来降解污染物，减少或最终消除污染的过程[1，2].这种方法也是最有前途的方法之一，通过这种有效和环保的方式来减少污染，既能降低石油烃在生产、运输、消费过程中对公众健康和自然资源产生的危害，而且成本低又能减少二次污染[3，4].石油烃是一种复杂的混合物，含有各种烃类主要有烷烃类：正烷烃、支链烷烃，芳香烃，脂环烃和不饱和烃等[5].在实际石油烃污染环境的微生物修复中，不同种属的微生物对石油烃的降解能力不同，且降解的石油烃的成分也不尽相同.目前，已报道能降解石油的微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母及藻类,其中以细菌种类最多[6],石油烃降解细菌主要有假单胞菌[7]、无色杆菌[8]、枯草芽孢杆菌[9]、炭疽杆菌[10]、绿脓杆菌[11]等.对总石油烃效果降解大多在50%～90%间.

目前研究中关于苍白杆菌与粘质沙雷氏菌及其与其他混合菌对总石油烃的降解研究较少，相关报道[12，13]，粘质沙雷氏菌对染料废水处理的好氧需氧阶段及促进植物生长有积极作用，主要用于药物如红霉素的降解及对除草剂如麦草畏的降解研究[14].本研究对炼油废水中筛选出的2种菌进行生理生化试验、16S rDNA 碱基序列分析及系统发育分类鉴定，并研究了苍白杆菌和粘质沙雷氏菌对总石油烃的降解效果.为石油烃污染环境的微生物修复提供基础数据和理论支持.

1 实验材料与仪器

1.1 实验菌株

菌株来源：从含油废水中筛选出降解石油烃的菌株，冷藏保存.

1.2 主要实验试剂

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2.

无机盐液体培养基(单位：mg/L)：(NH4)2SO42 000，K2HPO41 550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，FeSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O溶液与61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液混匀即得.

1.3 主要仪器设备

LD4-2A医用离心机、气相色谱仪(Agilent7890B)、手提式压力蒸汽灭菌器、SP-DJ系列垂直净化工作台HZQ-QX全温振荡器、JMS-6700F场发射扫描仪、PTC-200型PCR仪(美国)等.

1.4 总石油烃(简称TPH)测试分析方法

样品TPH采用气相色谱仪进行测定

色谱条件：[注入口SPL1]：注入方式：切片；温度：280.0 ℃；载气：氮气/空气；流量控制方式：压力；压力：59.5 kpa；流量总量：37.7 mL/min；柱箱流量：1.65 mL/min；线速度：30.9 cm/sec；清洗流量：3.0 mL/min；分流比：20.0；高压力注入：关闭；载气保存：关闭；分流器定位：关闭.[柱箱]：初始温度：80.0 ℃；平衡时间：3.0 min；总程序时间：31.50 min.[柱箱信息]：柱箱名：Rtx-1；序列号:10124；薄膜厚度：0.25 mm；柱箱长度：30.0 m；内径：0.32 mm ID；柱箱最大温度：330 ℃.[检测器通道1 DFID1]：温度：290.0 ℃；信号采集：是；采样速率：40 msec；停止时间：31.00 min；延迟时间：0.00 min；极性：+进样体积：1.0 μL.

2 实验方法

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 生理生化试验

分别对L2与L3菌株进行需氧性试验、产氨试验、甲基红试验、V.P试验、淀粉水解试验、接触酶试验、明胶液化试验、油脂水解试验、苯丙氨酸脱氨酶9项生理生化试验.

2.1.2 16SrDNA的扩增与测序

16SrDNA基因的PCR扩增引物：上游引物7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.

PCR扩增条件：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，共进行25个循环，最后4 ℃保温.取5 μL反应液与1 μL 6×上样缓冲液混合，在1%的琼脂糖凝胶中，于150 V电压下电泳检测.

引物合成及PCR产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成.

2.2 菌株降解石油烃效果、

取13个150 mL锥形瓶中分别加入50 mL无机盐培养液、200 mg 0#石油.其中1个不加菌作为空白对照，其余12个样品每6个分别加入5 mL同种石油烃降解菌溶液在600 nm波长处的吸光度(OD600)约为0.6于120 r/min、30 ℃下振荡培养6 d.每组实验设置2组平行样.每隔1 d取两个不同菌株样品，加入10 mL正己烷进行萃取.萃取后的有机相经无水硫酸钠干燥后用GC气相色谱仪测定TPH残留量，计算其降解率.TPH降解率公式见式(1)：

(1)

式中：η为TPH降解率，100%；C0为空白对照的石油烃质量浓度，mg/L，C1为降解后的石油烃质量浓度.

3 结果与讨论

3.1 菌体生理生化试验特性及分子鉴定

3.1.1 生理生化特性

对L2、L3菌进行了9项生理生化试验，测试结果如表1所示.

表1 菌株生理生化试验结果

注：+阳性，-阴性

3.1.2 菌株分子系统发育分析

将菌株16S rDNA序列输入Gen Bank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，以BLAST软件进行序列同源性比较，选择同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0软件对L2、L3进行系统发育分析，用Neighbor-joining法构建系统发育树，500次重复检测，计算自引导值(Bootstrap)以估计系统进化树的置信度.结果如图1、图2所示.

图1 L2菌基于16S rDNA序列的系统发育树

图2 L3菌基于16S rDNA序列的系统发育树

由图1可知：L2菌与Ochrobactrum ciceri(Ca-34)进化距离较近，结合生理生化特性，判定L2菌株在分类学属性为：苍白杆菌(Ochrobactrum ciceri).由图2可知：L3菌与serratia marcescens NBRC 202204进化距离较近，结合生理生化特性，判定L3菌株在分类学属性为：粘质沙雷氏菌(serratia marcescens).

相关研究还发现，菌株苍白杆菌可以利用玉米秸秆水解液中的生物聚合物不需要另外过量的磷酸盐，可大大降低微生物絮凝剂的生产成本[15].粘质沙雷氏菌经过144 h，对o-DCB的去除率可达90.41%，当Cr(VI)初始浓度低于40 mg/L时，菌株对Cr(VI)的去除率超过80%；而当Cr(VI)初始浓度高于40 mg/L时，菌株对Cr(VI)的去除率接近20%.对复合污染物同时具有去除作用[16].粘质沙雷氏菌还能发酵生产2，3-丁二醇在3.7 L发酵罐中进行补料发酵实验,在42 h 2,3-丁二醇浓度可达151 g/L,生产能力为3.59 g/L·h,产物得率为94.97%[17].目前，关于苍白杆菌和粘质沙雷氏菌降解石油在国内鲜有报道，因而，本文鉴定并研究两种菌株降解石油烃效果拓宽了降解石油烃菌株的种类.

3.2 两种菌珠菌株对石油烃降解效果对比图

初始石油烃浓度为4 000 mg/L时，L2、L3菌株对石油烃的降解率随时间变化如图3所示.

t/d图3 2种菌株对石油烃的降解率曲线

由图3可知：由于菌株的生长关系，2种菌株对石油烃的降解率在初始的2天处于对数期菌株以石油烃类为唯一碳源，菌株生长较快，酶活性也较高，增加较快，因此，对石油烃的降解率高.而3 d后菌株生长较为缓慢，因而，降解能力逐渐降低.6 d后，L2与L3 2种菌株对石油烃的降解率分别达到97.37%和98.98%.说明2种单菌对石油烃污染环境具有很强的生物修复潜力.

3.3 两种菌株降解石油烃气相色谱图

将空白组和各单菌降解石油烃6d后的样品进行气相色谱测定后，所得空白对照和L2、L3菌降解后的石油烃样品测定结果如图4，图5和图6所示.

t/min图4 石油烃气相色谱图(未降解前)

t/min图5 L2菌对石油烃降解6 d后气相色谱图

t/min图6 L3菌对石油烃降解6 d后气相色谱图

从图4、图5和图6可以看出L2、L3菌株对石油烃降解效果非常明显.石油其主要成分是碳氢构成的烃类化合物，烷烃、环烷烃、芳香烃约占石油成分的95%以上，绝大部分均可被微生物代谢降解[18，19].不同菌属的微生物对石油的降解能力也不同，石油烃本身性质也会对降解产生影响.一般认为，不同烃类化合物的降解率如下：小于C10的直链烷烃>C10-C24或更长的直链烷烃>小于C10的支链烷烃>C10-C24或更长的支链烷烃>单环芳烃>多环芳烃>杂环芳烃.低硫、高饱和烃的粗油最易降解，而高硫、高芳香族烃类化合物的纯油则最难降解[20].烷烃的降解途径主要有单一末端氧化、双末端氧化或ω-氧化、次末端氧化3种方式.上述两种高效石油烃降解菌株为其在石油烃污染环境的生物修复方面提供了新的参考理论依据.

4 结 论

采用16S rDNA技术对炼油废水中筛选出的2种菌进行鉴定，经生理生化特性及16S rDNA鉴定2种菌在分类学上L2、L3分别属于苍白杆菌(Ochrobactrum ciceri sp.)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens sp.).

将2种菌株用于石油烃降解，初始浓度为4 000 mg/L的石油，加入该菌株，120 r/min、30 ℃下振荡培养6 d后石油烃降解率高达97.37%和98.98%.