微小RNA- 143/145基因多态性与冠心病危险因素及严重程度的相关性

陈 芸，罗 至，曾 韡，赖飞呀，陈秋宏，吕 湛，宋永砚

川北医学院 1附属医院心内科 2临床医学系 3基础医学院生化教研室，四川南充 637000

随着我国人口老龄化及城镇化进程的加剧，心血管病发病人数持续增加。根据《中国心血管病报告2016》概要，我国心血管病现患人数约2.9亿，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位[1]。心血管病负担日渐加重，已成为我国重要的公共卫生问题。心血管病包括冠心病(coronary heart disease，CHD)、脑卒中和外周血管疾病等，其病理学基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)。AS主要由血浆脂质成分伴随炎性细胞缓慢沉积于血管内壁所致。CHD的危险因素包括高血压、糖尿病、高脂血症、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、高尿酸血症和高同型半胱氨酸血症等。相关基因变异是导致CHD危险因素聚集的主要原因，除此之外，体力活动减少、高脂高热量膳食和社会心理因素也是导致CHD危险因素增加的重要原因。微小RNA(microRNA，miR)- 143/145(miR- 143和miR- 145)基因位于人类5号染色体上，因两个微小基因彼此靠近被认为是在同一启动子的调控下进行转录的。miR- 143和miR- 145基因表达与CHD密切相关[2- 4]。Du等[3]报道早发性CHD患者血清中miR- 145水平较年龄和性别匹配的健康对照者显著降低。在CHD患者中，Yu等[4]发现经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄组血清中miR- 143水平较无再狭窄组显著降低。在miR- 143/145基因的启动子区存在两个单核苷酸变异位点rs353292和rs4705343。几项病例-对照研究显示这两个多态性位点与结肠癌[5]、宫颈癌[6]和缺血性脑卒中[7]的发生显著相关，但这两个位点是否也与CHD的危险因素及严重程度相关报道较少。本研究在我国汉族人群中，分析rs353292和rs4705343位点与CHD的危险因素及严重程度的相关性，为CHD的基因诊断和基因治疗提供理论基础。

对象和方法

对象选取2014年4月至2015年10月在川北医学院附属医院心内科就诊或住院治疗的无血缘关系的汉族人群。经冠状动脉造影确诊为CHD的患者380例，其中男性236例，平均年龄(60.0±9.6)岁；女性144例，平均年龄(64.3±8.1)岁。经冠状动脉造影诊断为非CHD的对照者163例，其中男性90例，平均年龄(59.5±12.7)岁；女性73例，平均年龄(58.7±10.2)岁。

临床资料收集通过生理生化检查，获得高血压、糖尿病、体质量指数、三酰甘油(triglycerides，TG)、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、hs-CRP、尿酸和同型半胱氨酸等反映心血管病危险因素的指标。

CHD诊断及严重程度分型CHD组及对照组所有成员均接受冠状动脉造影检查。CHD的诊断标准：至少有1支冠状动脉或其主要分支的管腔狭窄程度在50%以上者诊断为CHD。对照者的诊断标准：正常冠状动脉或轻微狭窄者(小于50%狭窄)，同时排除无状性心肌缺血、血管痉挛性心绞痛、心电图动态或负荷试验有ST段压低、T波倒置等患者。由两名经验丰富的心内科医生在对受试者病史和生理生化指标不知情的情况下行冠脉造影术。按Judkins法进行，在左冠脉系统设定至少4个观测点，右冠状动脉至少2个观测点。冠脉造影使用荷兰飞利浦的数字减影血管造影X线机(Allura Xper FD10)。CHD患者按严重程度分为心绞痛组和心肌梗死组，稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和急性心肌梗死的诊断采用中华医学会心血管病学分会制定的相关指南[8- 10]进行。

miR-143/145基因rs353292和rs4705343多态性分型基因组DNA从外周血白细胞中提取，采用TIANGEN公司的血液基因组提取试剂盒，操作过程按试剂盒说明书进行。PCR扩增含有miR- 143/145基因rs353292和rs4705343多态性位点的DNA片段。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为25 μl，其中DNA模板1 μl，上游和下游引物各1 μl，2×PCR TaqMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。rs353292位点的正向引物为5’-CTTTCTTCTGCCACTCCTCCT- 3’，反向引物为5’-GAAGGGCTTCAGAATTCCG- 3’；rs4705343位点的正向引物为5’-TCCATGTATTGAAATATCCAGAAAGTA- 3’，反向引物为5’-TGTGCAAACAATGGCACAAT- 3’。PCR扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56.5℃(rs353292)或60.0℃(rs4705343)40 s，72℃ 60 s，循环35次；72℃ 5 min。酶切反应体系(10 μl)：PCR产物3 μl，BslI(rs353292)或AccI(rs4705343)内切酶1.5 U，10×NEB缓冲液1 μl，ddH2O补至10 μl。37℃酶切过夜，2.5%琼脂糖凝胶电泳和GoldViewⅠ型核酸染色剂-紫外显色鉴定基因型。

统计学处理使用SPSS 13.0软件进行统计分析。连续性变量采用均数±标准差表示。不符合正态分布的计量资料(如TG)进行对数转换后纳入统计分析。采用χ2检验比较CHD患者与对照者之间、不同基因型者之间各种计数指标的差异。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较CHD患者与对照者之间、不同基因型者之间各种计量指标的差异，两两比较用LSD法，组内多重两两比较时作Bonferroni校正。采用χ2检验比较rs353292位点不同基因型者之间心绞痛和心肌梗死发生率的差异。通过检验Hardy-Weinberg平衡，评价样本的代表性。P≤0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床资料CHD组年龄(F=28.54，P<0.001)、患高血压的比例(χ2=12.72，P<0.001)、患糖尿病的比例(χ2=4.71，P=0.03)、TG(F=7.41，P=0.01)、总胆固醇(F=4.00，P=0.05)、载脂蛋白(apolipoprotein，APO)B100(F=7.70，P<0.01)、脂蛋白(a)(F=4.29，P=0.04)、血糖(F=4.14，P=0.04)和hs-CRP(F=9.11，P<0.01)水平显著高于对照组，HDL-C(F=8.39，P<0.01)和APO AI(F=9.76，P<0.01)水平显著低于对照组，差异均有统计学意义。体质量、体质量指数、LDL-C、VLDL-C、尿酸和同型半胱氨酸水平两组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1)。

基因型及等位基因分布频率rs353292和rs4705343位于miR- 143/145基因的启动子区，含有rs353292位点的PCR扩增片段长度为140 bp；含有rs4705343位点的PCR扩增片段长度为147 bp。rs353292位点由胞嘧啶(C)变异成胸腺嘧啶(T)生成，变异后限制酶BslI的识别序列(5’-CCNNNNN↓NNGG- 3’)和切割位点消失。在酶切后的电泳图谱上，TT基因型仅含有140 bp的1个片段；CT基因型含有140、120和20 bp的3个片段；CC基因型含有120和20 bp的两个片段。在电泳图谱上，20 bp的DNA片段因太小而检测不到(图1A)。rs4705343位点由T变异成C生成，变异后产生限制酶AccI的识别序列(5’-GT↓MKAC- 3’)和切割位点。在酶切后的电泳图谱上，TT基因型仅含有147 bp的1个片段；CT基因型含有147、121和26 bp的3个片段；CC基因型含有121和26 bp的两个片段。在电泳图谱上，26 bp的DNA片段因太小而检测不到(图1B)。miR- 143/145基因rs353292和rs4705343位点基因型及等位基因频率在CHD组与对照组之间差异均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。CHD组(χ2=27.89，P<0.05)和对照组(χ2=11.65，P<0.05)中rs353292位点基因型的分布频率的比较显示，变异纯合子(TT)比例增高，杂合子(CT)比例减低，差异具有统计学意义，但尚未达到Hardy-Weinberg平衡。CHD组(χ2=47.19，P<0.05)和对照组(χ2=9.33，P<0.05)中rs4705343位点基因型的分布频率的比较显示，变异纯合子(CC)比例减低，杂合子(CT)比例增高，差异具有统计学意义，但尚未达到Hardy-Weinberg平衡。

表 1 研究人群的临床特征Table 1 Clinical characteristics of the study population

CHD：冠心病；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；VLDL-C：极低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；hs-CRP：超敏C反应蛋白

CHD： coronary heart disease；LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol；VLDL-C： very low-density lipoprotein cholesterol；HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol；hs-CRP： hypersensitive C-reactive protein

M：DNA分子量标记；A：rs353292位点：1、2、3、4、5和8泳道为CC基因型，7泳道为CT基因型，6泳道为TT基因型；B：rs4705343位点：2和7泳道为TT基因型，1、3、4、5和6泳道为CT基因型，8泳道为CC基因型

M： DNA marker；A： rs353292 site： lanes 1，2，3，4，5 and 8 are CC genotype，lane 7 is CT genotype，and lane 6 is TT genotype；B： rs4705343 site： lanes 2 and 7 are TT genotype，lanes 1，3，4，5 and 6 are CT genotype，and lane 8 is CC genotype

图1含miR- 143/145 rs353292(A)和rs4705343(B)位点的DNA限制性内切酶谱

Fig1Gel electrophoresis map of the PCR products containing the rs353292(A) and rs4705343(B) polymorphisms of miR- 143/145 after digested by restriction endonucleases

表 2 对照组及CHD组中rs353292和rs4705343位点基因型及等位基因分布频率Table 2 The genotype and allele frequencies of the rs353292 and rs4705343 polymorphisms in the control group or CHD group

miR-143/145基因rs353292位点不同基因型之间临床资料比较在对照组中，TT基因型者TG(F=3.00，P=0.05)和血糖水平(F=9.91，P<0.001)高于C等位基因携带者，差异均有统计学意义。在CHD组中，TT基因型者hs-CRP(F=8.43，P<0.001)水平高于C等位基因携带者，差异有统计学意义(表3)。其他指标在rs353292位点不同基因型者之间的差异无统计学意义(P均>0.05)。

miR-143/145基因rs4705343位点不同基因型者之间临床资料比较在对照组中，TT基因型者患高血压的比例高于C等位基因携带者(χ2=6.35，P=0.04)，差异有统计学意义。其他指标在rs4705343位点不同基因型者之间差异均无统计学意义(P均>0.05)(表4)。

miR-143/145基因rs353292位点与CHD患者严重程度的相关性根据严重程度将CHD患者分为心绞痛组和心肌梗死组。TT基因型者中的心肌梗死发生率显著高于C等位基因携带者，差异有统计学意义(χ2=5.29，P=0.02)(图2)。

讨 论

miR- 143和miR- 145两个微小RNA基因位于人类第5号染色体上，miR- 145基因在miR- 143基因的下游，二者彼此靠近，仅相隔1.6 kb，因此认为它们是在同一启动子的调控下发生转录的，表示为miR- 143/145。rs353292和rs4705343是存在于miR- 143/145基因启动子区的两个单核苷酸变异位点，rs353292位点由转录起始点上游的第673位C变异成T生成，次要等位基因T在亚洲人中的变异率为0.16～0.34，高加索人中为0.44～0.50，非洲人中为0.09。rs4705343位点由转录起始点上游第400位T变异成C生成，次要等位基因C在亚洲人中的变异率为0.10～0.32，高加索人中为0.11～0.17，非洲人中为0.07(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)。

几项病例-对照研究结果显示这两个多态性位点与结肠癌、宫颈癌和颅内动脉瘤的发病相关[5- 6，11]，但这两个位点是否也与CHD的发病及其严重程度相关报道较少。本研究在CHD患者中发现rs353292多态性TT基因型者血清hs-CRP水平显著高于C等位基因携带者，同时在TT基因型患者中心肌梗死的发生率显著高于C等位基因携带者(53.3%比32.6%)，推测rs353292多态性可能是通过影响miR- 143/145的基因表达，进而影响hs-CRP的基因表达，促进心肌梗死的发生和发展。通过在线预测(http：//www.targetscan. org)，发现人类CRP基因的3’UTR区含有miR- 145的识别和结合位点，其中has-miR- 145- 3p可识别CRP基因下游第1773～1779 bp的核苷酸序列，has-miR- 145- 5p可识别CRP基因下游第603～609 bp、1098～1105 bp和1541～1547 bp的核苷酸序列。Yuan等[5]

表 3 miR- 143/145基因rs353292位点不同基因型者之间生理生化指标的比较Table 3 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs353292 genotypes

与CC基因型者比较，aP<0.05；与CT基因型者比较，bP<0.05

aP<0.05 compared with the subjects with the CC genotype；bP<0.05 compared with the subjects with the CT genotype

表 4 miR- 143/145基因rs4705343位点不同基因型者之间生理生化指标的比较Table 4 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs4705343 genotypes

与TT基因型者比较，aP=0.01

aP=0.01 compared with the subjects with the TT genotype

与C等位基因携带者比较，aχ2=5.29，aP=0.02

aχ2=5.29，aP=0.02 compared with C allele carriers

图2miR- 143/145基因rs353292位点不同基因型者中心绞痛及心肌梗死的发生率

Fig2Frequencies of angina pectoris or myocardial infarction in the genotype groups of the rs353292 polymorphism of the miR- 143/145 gene

采用双荧光素酶报告基因分析法发现rs353292多态性T等位基因对miR- 143/145基因的表达具有抑制作用。结合本研究结果推测，rs353292多态性T等位基因可能通过抑制miR- 145基因的表达，从而削弱miR- 145对CRP基因的抑制效应，导致CRP基因表达增强，血清hs-CRP水平升高，进而影响心肌梗死的发生和发展。然而，本研究在对照组中未观察到TT基因型者血清hs-CRP水平显著高于C等位基因携带者，可能原因之一是miRNA对靶基因的调控存在共调控网络，即一个miRNA 分子可能对上百个靶基因进行调控，而一个靶基因也可能被众多的miRNA同时调控[12]。在CHD患者中，miR- 145与其他miRNA共同作用于CRP基因，使其表达增强；而在对照组中，虽然miR- 145表达也增强，但其他miRNA的种类和数量的构成不同于CHD患者，因此对CRP基因的调控模式也不相同。

大量研究资料表明，AS并不是简单的脂质沉积过程，炎症反应和抗氧化失衡在AS的发生、发展中发挥重要作用。CRP是由肝细胞合成的一种相对分子质量约为115 000的血清β球蛋白。临床上通过高灵敏度方法检测出来的血液微量CRP，称为hs-CRP。hs-CRP是CHD的危险因素[13- 14]，其主要通过以下几种机制在AS的形成、发展中发挥作用：(1)抑制主动脉内皮细胞一氧化氮合酶的活性，减少一氧化氮的释放[15]。一氧化氮可扩张血管，并有抗氧化作用，减缓动脉硬化进程；(2)促进单核细胞趋化因子- 1、血管细胞黏附分子- 1和细胞间黏附分子- 1的分泌[16- 17]。单核细胞趋化蛋白- 1、血管细胞黏附分子- 1和细胞间黏附分子- 1可募集循环血单核细胞并发生黏附，加速AS进程；(3)促进巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白，形成泡沫细胞[18]。

本研究虽然在对照组中rs353292多态性与TG和血糖水平显著相关，但其基因型及等位基因频率在对照组与CHD组之间无差异。2013美国心脏病学会/美国心脏协会治疗血胆固醇降低成人动脉粥样硬化性心血管疾病风险指南[19]和美国国家胆固醇教育计划成人治疗组第3次指南[20]均将LDL-C作为心血管病第一干预和治疗目标，其他指标作为补充指标。TG和血糖水平与心血管病有一定的关联性，但直接沉积于血管壁，形成粥样斑块的脂质成分主要是胆固醇。尽管有报道rs4705343位点与宫颈癌[6]和颅内动脉瘤[11]显著相关，但本研究未观察到该位点与心血管病危险因素、CHD发病以及严重程度相关联，rs4705343位点与CHD的关系有待进一步探讨。

在对研究群体的Hardy-Weinberg平衡检验中，rs353292和rs4705343位点基因型频率在对照组和CHD组中的分布均不符合Hardy-Weinberg平衡，可能是因为本研究的对照组和CHD组均不是来源于随机抽样群体。对照组成员实际上是前往就诊的疑似冠心病患者，然后行冠状动脉造影术，但其冠脉狭窄程度没有达到冠心病的诊断标准，即至少1支冠状动脉或主要分支的管腔狭窄程度在50%以上。在对照组中，55%的参试者冠脉正常，34%的参试者有AS，11%的参试者有轻微的冠脉狭窄(<50%)。

综上，在我国汉族人群中，miR- 143/145基因rs353292多态性在非CHD对照者中与血浆TG和血糖水平升高相关联，在CHD患者中与血清hs-CRP水平升高和心肌梗死风险增加相关联。miR- 143/145基因rs4705343位点在非CHD对照者中可能与高血压发病相关联，但与CHD的发生和发展无相关性。