高氧对新生大鼠脑内谷氨酸及其转运体的影响

王丹丹，刘光辉，赵钰玮，张 健

新生儿缺氧性疾病是围生期最常见的疾病之一，氧疗能够纠正低氧血症和高碳酸血症，维持良好的呼吸功能，是治疗新生儿缺氧性疾病的重要措施。但目前证实高浓度氧气可能会引起视网膜病变[1]和慢性肺部疾病[2]，越来越多的实验数据表明，高氧可能引起或加重新生儿脑损伤，增加神经系统后遗症的发生率[3]。谷氨酸(glutamate，Glu)是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，过多的Glu通过激活谷氨酸受体引起兴奋性毒性作用，导致中枢神经系统内神经元的损伤[4]。该研究拟对新生6 d大鼠给予暴露80%高浓度氧，建立新生大鼠高氧模型，以研究高氧状态下脑组织内Glu及其转运体的变化，探讨使用高浓度氧气后神经系统中Glu的代谢机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂

1.1.1实验材料 清洁级健康新生6 d大鼠19 只，雄雌不限，购自安徽医科大学实验动物中心。高氧箱(美国BioSpherix公司，型号Ltd.P.O.Box279)；Glu及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)检测试剂盒(南京翼飞雪生物科技公司)；GLAST、GLT-1、EAAC1、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2一抗(英国Abcam公司)；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.1.2新生大鼠高氧模型制备及分组 将新生6 d清洁级健康新生大鼠19只随机分为高氧组和对照组，高氧组10 只，对照组9 只。高氧组与哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，持续通入100%医用氧气，并用数字测氧仪持续检测箱内氧气浓度，维持箱内氧气浓度始终≥80%，对照组与哺乳母鼠置于同室空气中饲养。造模结束后，分别取高氧组5 只和对照组4 只新生大鼠行ELISA实验检测两组大鼠脑组织Glu/GABA比值变化；两组剩余各5 只新生大鼠行Western blot法检测两组大鼠脑组织中谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达变化情况。

1.2方法

1.2.1标本采集及处理 将新生7 d大鼠用10%水合氯醛2.0 ml/只麻醉后，随机取高氧组5 只、对照组4 只剪开大鼠右心耳，然后在大鼠左心室缓慢灌注磷酸盐缓冲溶液(PBS)用于排出全身血液，然后迅速断头取脑，转入-80 ℃超低温冰箱中保存，用于Glu及GABA蛋白含量的检测；另随机取5 只迅速断头取脑，转入-80 ℃超低温冰箱中保存，用于谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的检测。

1.2.2Glu及GABA蛋白含量 取出冻存脑组织，称取100 mg移入玻璃匀浆器，加入预冷的PBS，冰上充分研磨，将制备好的匀浆液以12 000 r/min离心5 min，收集上清液，采用ELISA法测定Glu及GABA的蛋白含量，严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3谷氨酸转运体的表达 使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸化抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白。吸取适量蛋白上样至12%聚丙烯酰胺凝胶，转膜至硝酸纤维素膜。一抗孵育过夜，适当浓度的二抗孵育1 h。添加ECL化学发光显影液后曝光，扫描仪采集图像，Quantity Oner软件分析条带灰度值，计算目标蛋白与内参蛋白的比值。一抗为EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2，β-actin为蛋白内参。

2 结果

2.1两组大鼠脑组织Glu/GABA比值变化高氧组脑组织内Glu/GABA的比值2.69(2.43,3.08)较对照组1.06(0.57,2.03)明显增高，差异有统计学意义(Z=-2.205，P=0.032)。

2.2两组大鼠脑组织的谷氨酸转运体蛋白含量变化Western blot法检测两组脑组织中谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达变化情况。与对照组比较，谷氨酸转运体EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(t=5.206、2.785、2.892、2.611，P=0.000 8、0.023 7、0.020 1、0.031 1),而EAAT1、GLUT3和VGLUT1的蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 Western blot法测定脑组织中谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达

A：EAAT1/β-actin;B:EAAT2/β-actin;C:EAAT3/β-actin;D:GLUT1/β-actin; E:GLUT3/β-actin;F:VGLUT1/β-actin;G:VGLUT2/β-actin;与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

Glu是中枢神经系统内重要的神经递质，参与机体正常情况下一系列的生理活动。在生理情况下，Glu的合成、分解、摄取和重吸收处于动态平衡中[5]。而在缺血、缺氧等病理情况下，Glu的摄取及转运会发生障碍，引起Glu的堆积，而突触间隙中的Glu的大量堆积会导致神经元的毒性作用，最终可能导致中枢神经系统神经元的凋亡或坏死[6]，造成一定程度的脑损伤。Glu维持在神经元细胞外的低浓度主要依赖于谷氨酸转运体，Glu通过谷氨酸转运体进入到神经胶质细胞内转化为谷氨酰胺，从而保护神经元，避免兴奋性毒性对神经元的损伤作用[7]。另外有研究[8]表明，高氧会导致神经元细胞外Glu浓度增高，可能是高氧导致脑损伤的机制之一。

在未成熟脑内，兴奋性氨基酸的过度释放，会造成脑损伤。Glu和GABA是脑内主要的兴奋性和抑制性神经递质，在生理情况下，两者保持动态平衡，Glu/GABA体现了两者之间的动态平衡关系。Glu作为主要的兴奋性氨基酸，在突触间隙内大量积聚，会导致NMDA受体过度激活，受体门控型离子通道开放，Ga2+、Na+大量内流，K+外流，钠水滁留，导致神经元的急性肿胀、坏死。离子通道的大量开放使细胞内Ga2+的浓度持续增高，造成细胞内钙超载:Ga2+可激活细胞内一系列酶，包括蛋白激酶C、一氧化氮合酶、磷脂酶等,这一系列酶的激活导致了神经元内自由基增多、神经元膜磷脂降解、神经元骨架破坏，使神经元凋亡或者坏死。本研究显示，新生6 d的大鼠在高氧暴露24 h后，Glu/GABA的比值明显升高，说明中枢神经系统中兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸之间的动态平衡关系被打破，兴奋性氨基酸在突触间隙内大量积聚，NMDA受体过度激活，兴奋性毒性作用造成神经元的凋亡、坏死。且有研究[9]显示，Glu/GABA的比值越高，兴奋性毒性对神经元的损伤越重。本研究显示高氧后Glu/GABA的比值明显升高，可能对中枢神经系统内神经元造成了损伤作用。

谷氨酸转运体的表达降低，导致了Glu在突触间隙中的堆积。EAAT1、EAAT2、EAAT3是高亲和力谷氨酸转运体，主要表达于神经元及神经胶质细胞膜上，是调节中枢神经系统内Glu浓度的主要转运蛋白，成人脑组织中约有90%的Glu转运都依赖于EAAT2来完成[10]。GLUT1、GLUT3是脑型葡萄糖转运体，主要是将葡萄糖跨血脑屏障转运至神经元内[11]，且葡萄糖通过GLUT1和GLUT3跨过细胞膜是易化扩散的过程。VGLUT1、VGLUT2是低亲和力谷氨酸转运体，主要分布于囊泡膜上，能够特异地将神经元胞质内的谷氨酸转运进入突触囊泡内[12]。每个囊泡中转运体蛋白的数量和囊泡外谷氨酸浓度决定了Glu进入囊泡的流速，影响着囊泡内神经递质的最高水平[13]。本实验检测了两组新生大鼠脑组织中谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达水平的变化。结果显示，与对照组比较，高氧组EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2水平均明显降低，差异有统计学意义；而高氧组EAAT1、GLUT3和VGLUT1与对照组比较，差异无统计学意义。这个结果说明新生大鼠中枢神经系统内谷氨酸转运体在高氧中转运谷氨酸的能力降低，且随着氧气浓度的增加，谷氨酸转运体转运Glu的能力越低，脑损伤越严重[14]。同样有研究[8,15]表明，高氧后或者是在Glu堆积的情况下，谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达水平会降低。

本实验显示，高氧组新生大鼠脑组织中谷氨酸转运体EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表达水平均降低，GLUT1表达的降低，减少了葡萄糖从血液跨过血脑屏障进入脑组织的数量，使脑组织处于缺乏能量的状态；当新生大鼠在高氧中， EAAT2和EAAT3的表达降低，且EAAT2和EAAT3转运谷氨酸是一个耗能的过程，使谷氨酸转运体EAAT2和EAAT3转运谷氨酸的能力愈发降低；在生理情况下，中枢神经系统内的Glu主要储存于突触前膜神经元的囊泡内， VGLUT2的表达降低，不能有效地将Glu储存于突触囊泡内，加重了突触间隙内Glu的堆积，这与本研究显示的高氧组Glu/GABA的比值升高相一致。

综上所述，高氧可导致新生大鼠脑组织内的Glu增高，其机制与转运体EAAT2、EAAT3、GLUT1、VGLUT2的蛋白表达下降有关，Glu增加可能是高氧造成脑损伤的原因之一。