小鼠第一极体基因组移植的时间窗探索

袁 锦，纪冬梅，邹薇薇，武龙梅，章志国，曹云霞

近年来随着哺乳动物核移植技术的发展和完善，人们对极体功能的探究也逐步深入[1-2]。1998年至今，科学家先后以小鼠、猪和人为研究模型，证实第一极体染色体具有参与胚胎发育的能力，确认了第一极体基因组移植的可行性[3-6]，认为其在卵子缺陷所致的不孕不育治疗、线粒体遗传病治疗等方面具有较为广泛的再利用价值[7-9]。但对第一极体应用效率尚未深入探究。该研究旨在探讨第一极体从刚排出到趋于退化过程中，各个时间段的小鼠第一极体是否都可以参与构建重构卵子并重获正常受精和发育的能力；同时筛选出第一极体基因组移植的最佳时间窗。为深入挖掘哺乳动物第一极体生殖潜力，提高第一极体再利用效率提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物 清洁级BDF1杂交鼠共20只，6～8周龄，体质量20～28 g，购自南京大学南京生物医药研究院。

1.1.2试剂和耗材 Gamete培养液(脱除颗粒细胞后洗涤卵子和显微操作液所需)、Fertilization培养液、Cleavage培养液(受精卵的体外培养所需)均购自澳大利亚COOK公司。细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)(取出纺锤体染色体复合物前处理卵子所需)、透明质酸酶(脱除卵丘卵母细胞复合物的颗粒细胞所需)均购自美国Sigma公司。7%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)(显微操作液所需)购自美国Sage公司。孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)(超促排卵所需)均购自宁波第二激素厂。

1.2实验方法

1.2.1超促排卵 将BDF1雌鼠随机分组，供核组小鼠均于20:00注射PMSG(7.5 IU/只)，间隔48 h后注射hCG(7.5 IU/只)。供胞质组小鼠分别于18：30、19：30、20：30、21：30注射PMSG(7.5 IU/只)，间隔48 h后分别注射hCG(7.5 IU/只)。

1.2.2MII卵母细胞的采集 核供体MII卵子的获取：颈椎脱臼法分别处死hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的4组F1雌鼠，手术剪下输卵管置于gamete液滴中，体视镜下用尖镊子撕开输卵管壶腹部，获取卵丘卵母细胞复合物，将卵冠丘复合物置于透明质酸酶中，37 ℃消化3 min，用移卵针轻轻吹吸脱除颗粒细胞，获取MII裸卵。将MII裸卵置于gamete液滴中洗涤5次洗去透明质酸酶，移入cleavage液滴中，置37 ℃、5% CO2培养箱中备用。

胞质供体MII卵子的获取：颈椎脱臼法处死hCG后14 h的F1母鼠，以上述相同的方法获取MII卵子备用。

1.2.3胞质供体卵子去核 将供胞质的卵子移入含5 μg/ml CB的gamete操作液滴中,置于37 ℃恒温板上，处理10 min，将纺锤体区域调整至3点钟方向后，用持卵针固定卵子，使用激光破膜仪在3点钟位置给透明带打孔。用内径10 μm的去核针通过透明带破口，轻轻吸出纺锤体弃去。收集去核后的卵子备用。

1.2.4第一极体的获取 将供核的卵子移入gamete操作皿中，置于37 ℃恒温板上，调整至极体位于12点钟方向，用持卵针固定卵子，使用激光破膜仪在2点钟位置给透明带打孔，用内径8 μm的注射针吸取第一极体备用。

1.2.5卵母细胞的重组 将注射针中的极体轻轻吹出吸回，以确定极体包膜已破，注射针通过3点钟方向的透明带破口，将第一极体注入已去核的胞质供体卵子内，轻轻退针，获得第一极体基因组移植重构卵子。将重构卵子移入cleavage培养皿，置37 ℃、5% CO2培养箱中恢复。

1.2.6重构卵子的体外受精和培养 从F1公鼠附睾尾和输精管中获取精子，移入fertilization培养皿中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行获能。精子获能大于1 h后，向预先准备好的各个体外受精液滴中加入适量精子，分别移入各组重构卵。5 h后观察受精情况。洗脱精子后移入cleavage培养皿，置37 ℃、5% CO2培养箱中进行后续培养。

1.2.7对照组卵子的体外受精和培养 获取MII卵子，脱除颗粒细胞后移入fertilization培养液滴中，加入适量源自F1公鼠的已获能的精子。5 h后观察受精情况。洗脱精子后移入cleavage培养皿，置37 ℃、5% CO2培养箱中进行后续培养。

1.3统计学处理数据经Prism 6.0 (GraphPad)软件处理，重构胚存活率、受精率、2细胞形成率、4细胞形成率和囊胚率的比较均使用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同时间PB1T重构胚制备成功率和体外受精情况根据表1、图1A和图2可见，hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的卵子排出的第一极体作为核供体，PB1T重构胚存活率与对照组(100.0%)比，差异无统计学意义(88.0%、92.0%、92.3%、89.3%，P>0.05)，其中13.5 h和14.5 h组存活率高于其他实验组。根据表1和图1B可见，12.5、13.5、14.5 h组体外受精率和对照组(87.5%)比较，差异无统计学意义(81.8%、91.3%、83.3%,P>0.05)，其中13.5 h组体外受精率在实验组中最高。15.5 h组重构卵子的体外受精率为76%，在实验组中最低，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.020 0)。

2.2不同时间第一极体移植重构胚体外发育情况根据表1和图1C、D、E可见，13.5 h组重构胚的2细胞、4细胞以及囊胚形成率分别为95.2%、95.0%和84.2%，在实验组中均最高。与对照组(100%)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。12.5 h组重构胚的2细胞、4细胞以及囊胚形成率为83.3%、80.0%、75%,14.5 h组重构胚的2细胞、4细胞以及囊胚形成率为85.0%、88.2%、73.3%，这两组与对照组相比(100.0%、95.2%、90.0%)，差异无统计学意义(P>0.05)。15.5 h组重构胚的2细胞和4细胞形成率为89.5%和70.6%，与其他组相比，差异无统计学意义。其囊胚形成率为41.7%，在实验组中最低，与对照组相比，差异有统计学意义(P=0.005 7)。

表1 重构胚的体外受精和发育情况 [n(%)]

与对照组比较：*P<0.05**P<0.01

图1 不同时间PB1T重构胚的体外存活和发育情况

A：不同时间PB1T重构胚的存活率(存活数/卵子数)；B：不同时间PB1T重构胚的体外受精率(受精数/存活数)；C：不同时间PB1T重构胚的2细胞形成率(2细胞数/受精数)；D：不同时间PB1T重构胚的4细胞形成率(4细胞数/2细胞数)；E：不同时间PB1T重构胚的囊胚率(囊胚数/4细胞数)；与对照组比较：*P<0.05**P<0.01

图2 第一极体基因组移植重构胚发育图 ×200A：重构受精卵；B：重构胚分裂为2细胞；C：重构胚分裂为4细胞；D：重构胚发育成囊胚

2.3不同时间第一极体形态变化如图3所示，hCG后12.5 h大多卵子刚开始排出的第一极体，此时间点第一极体呈扁椭圆体，边界清晰，没有与卵胞质完全分离。如图4A所示，部分第一极体中的染色体与胞质中染色体没有彻底分离。hCG后13.5 h时，第一极体与卵胞质完全分离。呈较为饱满的椭圆体，边界清晰。卵周间隙稍变大。hCG后14.5 h，第一极体开始向圆球体变化，卵周间隙进一步变大。hCG后15.5 h，第一极体膨胀呈球体，边界开始淡化，逐渐趋于瓦解退化。

图3 不同时间的第一极体形态 ×200A:hCG后12.5 h的第一极体；B: hCG后13.5 h的第一极体；C: hCG后14.5 h的第一极体；D: hCG后15.5 h的第一极体

图4 不同时间的第一极体染色体与胞质中纺锤体分离情况 ×200A:hCG后12.5 h的MII卵子；B:hCG后13.5 h的MII卵子；C:hCG后14.5 h的MII卵子；D. hCG后15.5 h的MII卵子

3 讨论

虽然科学家在前期研究中已经证实，第一极体的基因组具有支持重构卵子正常受精、发育并获得子代的生殖能力。对极体功能的认识获得了突破性的进展。但是，因为小鼠第一极体排出后存活时间很短，在进行第一极体基因组移植的研究中，第一极体的选择和分离时间窗是实验的关键因素。是否所有时间段的第一极体都可以作为移植核供体，何时最适宜进行第一极体基因组移植，前期报道尚未对此进行深入探究。由于第一极体排出后，留在卵母细胞胞质中染色体一直处于第二次减数分裂中期阶段，而第一极体会逐渐走向退化消散[10]。设想最早刚刚从初级卵母细胞中排出的最新鲜的第一极体可以更好地保持与卵母细胞胞质环境的同步性，其染色体活性更利于重构卵子的存活和后续发育。因此，本实验根据极体从刚刚排出即hCG后12.5 h到趋于退化消散即hCG后15.5 h的生理状态和时间跨度，设立了4个时间点进行探究。

根据实验结果可见，从hCG后12.5 h到15.5 h，4个时间点的小鼠第一极体作为核供体，都可以成功构建重构卵子，正常受精，卵裂发育至囊胚。说明这4个时间点的第一极体染色体在被移入去核的卵母细胞胞质中后，均可以快速经历凝集重构和调控细胞周期的重新编程，支持卵母细胞的后续发育。但实验过程中显示，12.5 h大部分第一极体刚刚排出，呈扁椭圆形，与胞质没有完全分离。由于胞质骨架蛋白的牵拉作用，在取第一极体的操作过程中，经常会将胞质中的染色体和部分胞质连带同时取出，无法彻底分离。造成12.5 h组第一极体的获取效率较低。虽然12.5 h组存活的重构卵子在后续的体外受精率、卵裂率和囊胚形成率上与对照组没有显著差异。可以认为，对于刚刚排出的最新鲜的第一极体，其染色体发育阶段可以很好的与卵母细胞胞质保持同步性。但是此时间点第一极体染色体分离率低，导致操作成功率低下，因此该时间点不是第一极体基因组移植的最佳选择。

15.5 h组第一极体已经趋于退化，极体包膜逐渐变淡，极体胞质变粗糙。此时的第一极体基因组虽然可以支持重构卵母细胞受精和发育，但受精率显著低于其他组。囊胚生成率也显著低于对照组。不适宜选作第一极体基因组移植的时间窗。

相比之下，13.5 h和14. 5 h组的第一极体作为核供体，构建重构卵子的存活率、体外受精率、卵裂率和囊胚形成率与对照组相比没有显著差异。说明在这两个时间窗内，第一极体染色体的发育状态与卵母细胞胞质依旧保持较好的同步性。重构卵母细胞可以顺利重新编程，进而进行受精，第二次减数分裂和卵裂等发育过程。因此，可以认为hCG后13.5～14.5 h是小鼠第一极体基因组移植的最佳时间窗。

在培养过程中，还发现各组PB1T重构胚的2细胞、4细胞以及囊胚生成时间均迟于对照组。受精后早期胚胎发育主要依赖于母性遗传的胞质RNA和蛋白质调控[11]。因此重构胚的发育出现迟缓现象，可能是由于第一极体被注入胞质供体卵子时，会带入少量同源胞质，染色体对异源胞质环境需要适应过程，对同源与异源胞质的调控先后次序和协调性存在调整过程。胞质状态也是重构胚发育迟缓的另一关键因素。胞质供体在去核时需要经历CB的处理，CB会增加胞质柔韧性，降低去核操作时卵子的死亡率，但也会抑制胞质中微丝微管的形成，影响重组卵母细胞的正常受精和发育[12]。因此，去核完成后，应注意延长洗涤次数和时间以彻底洗涤CB。即使残留少量的CB 也可能对重构卵子的正常受精、卵裂产生很大的影响。除此之外，显微操作对卵子的损伤，操作过程中的温度变化，培养试剂成分的优化，胞质供体卵子去核时带出的胞质量等均对移植成功率和后续发育率存在影响[13-15]。