磷酸肌酸对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化的影响

戴永国，蔡立飞，杨 洋，韩国柱，孙慧君

(大连医科大学 药学院 临床药理学教研室，辽宁 大连 116044)

随着中国人口老龄化的日趋严重，骨质疏松症是中国正在面临的重要公共健康问题之一，其特点是以骨量减少，骨组织显微结构损害，骨脆性增加，骨强度下降和骨折风险性增加为标志的一种全身性的骨代谢障碍性疾病[1-3]。“骨重建”是维持骨骼完整性的重要过程[1]。当破骨细胞介导的骨吸收强于成骨细胞介导的骨形成时，骨重建呈负平衡，造成骨丢失，产生以骨质疏松为代表的病变状态。因此，加速成骨细胞成骨分化，恢复骨重建平衡，从而改善骨质量，对骨质疏松的治疗至关重要。三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)是一种核苷酸，在核酸的合成中具有重要作用，同时也是体内能量的直接应用形式以及重要的信号分子。相关研究表明，在机械负荷或组织损伤后可促进骨细胞以自分泌或旁分泌方式释放ATP 作为化学信使，然后可通过P2X7 受体的激活调节多种细胞活性促进成骨[4-7]。最近一些研究通过使用外源性ATP 作用于骨髓间充质干细胞和成骨细胞后，发现外源性ATP 同样也可以促进其成骨分化和矿化[8-11]。此外，动物实验还发现外源性ATP 可促进大鼠桡骨骨折愈合[12]。磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)是一种高能磷酸化合物，是人体和动物体内高能磷酸基的暂时贮存形式，是细胞能量代谢的重要物质之一。在生命活动中，体内大量消耗的ATP 可快速通过肌酸激酶的作用将PCr 的磷酸基转移到ADP 分子上生成ATP 得到补充。目前，外源性PCr 主要作为一种高效低毒心肌保护剂用于临床和作为一种不违法兴奋剂规定的运动补剂[13-15]。然而，PCr 作为一种ATP 的补充剂是否可促进成骨细胞分化和矿化还未见报道。因此，本研究旨在探究PCr 是否可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化，而成为一种预防骨质疏松和促进骨折愈合的药物，增加其临床适应证。

1 材料和方法

1.1 实验药物和试剂

磷酸肌酸注射用无菌粉针剂，内含磷酸肌酸二钠盐四水合物，规格：1 g(按C4H8N3O5PNa2计)，购于哈尔滨博莱制药有限公司(批号：070823，纯度 > 97%)。

DMEM 高糖培养基、胎牛血清(Gibico 公司)；维生素C、MTT、TritonX-100(Amresco 公司)；0.2%茜素红S 染色液、β-甘油磷酸钠(Solarbio 公司)； 碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA 试剂盒、GAPDH抗体、ECL 显色试剂盒、Western及IP裂解液(碧云天生物技术研究所)；ALP、BMP-2 抗体(中国武汉三鹰生物技术有限公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG 二抗、辣根酶标记山羊抗鼠IgG 二抗(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 实验仪器和设备

二氧化碳孵育箱(Thermo 公司)；倒置显微镜TS100(日本Nikon 公司)；Air Tech 超净工作台(博讯实业有限公司)；Thermo 354 酶标仪和低温超速离心机(赛默飞世尔科技公司)；MLS-3750 高压灭菌器(日本Sanyo 公司)；PS 9 型半干式转移电泳仪和垂直电泳仪(大连竞迈有限公司)；Amersham Imager 600 凝胶成像系统(GE Healthcare)。

1.3 细胞培养与实验分组

MC3T3-E1 细胞株购于中科院上海细胞生物学研究所。细胞用含10 % 胎牛血清的DMEM 培养基培液(培养基中加入100 U·mL-1的青霉素、100 U·mL-1的链霉素)，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下的恒温培养箱中培养，隔1 d 更换一次培养液。当细胞融合度达80%～90%后进行传代培养。用含10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠和50 mg·L-1维生素C 的培养液来作为矿化诱导培养液诱导MC3T3-E1细胞成骨分化。实验分为空白对照组(Control组)、PCr低剂量组、PCr中剂量组、PCr高剂量组。Control组不给予PCr药物处理；PCr低、中、高剂量组分别给予5、10、20 mmol·L-1的PCr进行药物处理。

1.4 MTT 法检测细胞增殖情况

将MC3T3-E1 细胞以1×105· mL-1的细胞密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL 细胞悬液，在体积分数为5%CO2、37 ℃ 的细胞培养箱中继续培养24 h后，弃去原细胞培养液，用PBS 洗涤细胞，加入含有PCr(5,10,20 mmol·L-1)的无血清培养基培养12 h、24 h 和48 h，之后通过MTT 法测定细胞的增殖情况。向每个孔中加入10 μL MTT 溶液(5 mg·mL-1)，然后继续孵育4 h。 孵育4 h 后，除去MTT 溶液，之后加入三联液，每孔100 μL，孵育过夜。用酶标仪测定570 nm 的OD570 值。

1.5 ALP活性的测定

PCr 对MC3T3-E1 细胞ALP 活性影响的实验参照文献[16]的方法进行给药后测定。MC3T3-E1 细胞接种于24 孔细胞培养板中，培养24 h 后，更换为矿化诱导培养液，继续在体积分数为5 % CO2、37 ℃ 的细胞培养箱中继续培养7 d，每天换液1次。然后弃去原细胞培养液，加入含有不同浓度PCr(5,10,20 mmol·L-1)的培养液处理24 h 后测定ALP活性，即：将细胞用预冷的PBS 洗2 次后，用0.2% Triton X-100 裂解细胞20 min，收集裂解液于1.5 mL EP管中，4 ℃、14000 g 离心10 min，取上清液。用碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒测定ALP含量，并用BCA试剂盒测定蛋白总含量，按照碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒说明中提供的公式计算单位蛋白中ALP 的含量。

1.6 Western Blot 检测ALP、BMP-2 蛋白表达情况

MC3T3-E1 细胞接种在6 孔细胞培养板中，经PCr(5,10,20 mmol·L-1)处理24 h 后，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取细胞全蛋白，然后用BCA 试剂盒测定蛋白总含量，调节各组蛋白至同一浓度。在定量好的蛋白内加入等体积的2×loading buffer，100 ℃ 变性5 min，然后，将制备好的蛋白样品置-20 ℃ 冰箱保存备用。SDS-PAGE 电泳时，各组取20 μg 蛋白质样品进行上样，经电泳分离后，将蛋白质电转至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉在37 ℃ 水浴中封闭2 h，然后分别加入GAPDH、BMP-2、ALP 的一抗，4 ℃ 过夜；次日TBST 洗膜(3 次，每次10 min)后加入辣根酶标记山羊抗兔(或抗鼠)IgG 二抗，室温孵育2 h；然后经TBST 洗膜(3 次，每次10 min)后，用ECL 显色液将膜显色之后置于凝胶成像系统中进行拍照，分析蛋白条带光密度值。

1.7 茜素红染色法检测细胞形成的矿化结节

阳性茜素红染色是一种常见的组织化学技术，用于检测矿化组织和培养细胞中的钙沉积。本研究采用茜素红染色观察MC3T3-E1 细胞的矿化结节形成情况。将MC3T3-E1 细胞接种在12 孔细胞培养板中，待细胞长成细胞单层后，弃去原培养液，加入不同浓度的PCr 药液(5,10,20 mmol·L-1)处理24 h后，用矿化诱导培养液处理28 d。然后，将MC3T3-E1 细胞用PBS 洗涤后，在95%的乙醇中固定15 min，双蒸水漂洗，用0.2%茜素红S(pH8.3)染色45 min，再用PBS漂洗细胞以减少非特异性染色。最后，低倍显微镜下(×4)视野下观察，深红色的阳性染色结节为形成的矿化结节，并随机选取6个视野，记录矿化结节数目，倒置显微镜照相。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 PCr 对MC3T3-E1 细胞增殖的影响

MTT 法检测PCr 对MC3T3-E1 细胞增殖的影响的结果显示：与Control 组相比，当PCr (5,10,20 mmol·L-1)作用12 h 后，PCr 对MC3T3-E1 细胞无促增殖作用(P>0.05)；作用24 h 后，10 mmol·L-1的PCr 对MC3T3-E1 细胞有一定的促增殖作用(P<0.05)，见表1；而5 和20 mmol·L-1的PCr 无显著增殖作用(P>0.05) ；作用48 h后，各浓度的PCr 对MC3T3-E1 细胞均具有显著的促增殖作用(P<0.01)，分别达到137%、146%、153%。见表1。

组别OD57012 h24 h48 hControl组 0.428±0.069 0.437±0.040 0.984±0.134PCr(5 mmol·L-1)组 0.424±0.065 0.550±0.037 1.346±0.0972)PCr(10 mmol·L-1)组 0.414±0.030 0.594±0.0311) 1.438±0.1292)PCr(20 mmol·L-1)组 0.417±0.021 0.569±0.023 1.504±0.0552)

与Control 组相比，1)P<0.05；2)P<0.01

2.2 PCr 对MC3T3-E1 细胞ALP 活性以及ALP 和BMP-2 蛋白表达的影响

碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒检测ALP 的活性，结果显示：与对照组相比，MC3T3-E1 细胞在PCr 处理后，10和20 mmol·L-1的PCr 可使ALP 的活性提高1.37和2.14倍(P<0.05,P<0.01)，见图1A。同时，通过Western Blot 检测ALP 蛋白表达水平，结果显示：与Control组比较，5 mmol·L-1的PCr对ALP 蛋白的表达无明显影响(P>0.05)，而当PCr浓度为10和20 mmol·L-1时可以明显上调ALP 蛋白的表达水平(P<0.01,P<0.01)，见图1B。

Western Blot 检测BMP-2 蛋白表达水平，结果显示：与Control组比较，PCr(5、10和20 mmol·L-1)可以明显上调BMP-2 蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，见图1C。

A: ALP 活性; B: ALP 蛋白表达；C: BMP-2 蛋白表达。与Control组相比，*P<0.05,**P<0.01图1 PCr 对MC3T3-E1细胞ALP 活性以及ALP和BMP-2蛋白表达的影响Fig 1 Effect of PCr on ALP Activity,ALP and BMP-2 expression in MC3T3-E1 cells

2.3 PCr 对MC3T3-E1 细胞形成矿化结节的影响

茜素红染色后，细胞形成的矿化结节被染成深红色，可以通过显微镜进行观察，见图2A。结果显示：与对照组矿化结节数(7±3)个相比，PCr浓度为5、10和20 mmol·L-1组中的矿化结节数显著地增加，数量分别达到(17±5)个、(20±3)个、(31±5)个，具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)，见图2B。

A:细胞形成的矿化结节。茜素红染色，比例尺：200 μm，箭头示矿化结节；B:各组矿化结节数统计。与Control 组比较，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001图2 PCr 对MC3T3-E1 细胞形成矿化结节的影响Fig 2 Effect of PCr on the formation of mineralized nodules in MC3T3-E1 cells

3 讨 论

外源性PCr 是在短期和长期使用时均无潜在毒性的高能磷酸化合物，目前主要用于：(1)医疗用途——用于心脏问题，营养心肌、改善心肌代谢[13,15]；(2)体育用途——用于提高肌肉力量、补充能量[14]。药代动力学研究表明，外源性PCr 肌注或静脉给药后，可很快使血液中ATP 水平升高。因此，外源性PCr 是一种补充体内ATP 水平的低毒药物。近年来有关研究表明，外源性ATP 具有促进成骨的作用和促进骨折愈合的作用：(1)它可促进骨髓间充质干细胞和成骨细胞的成骨分化与矿化[8-11]；(2)它可促进大鼠桡骨骨折愈合[12]。于是，猜测外源性PCr 可能也有潜在的促进成骨的作用。

在骨生长发育过程中，骨重建平衡对于维持骨骼健康起到了很重要的作用[1]。当骨重建呈负平衡时(即：骨吸收强于骨形成时)，发生骨丢失，产生以骨质疏松为代表的病变。骨重建是多个基本细胞单位(包括成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)参与完成的一系列复杂的代谢过程。其中成骨细胞与骨形成关系最为密切，是成骨的决定因素。在骨形成过程中，成骨细胞需要经历成骨细胞增殖、细胞外基质分化与成熟、细胞外基质矿化等阶段成骨[17-18]。MC3T3-E1细胞系具有极好的成骨分化潜能，是体外研究骨细胞增殖、分化与矿化的细胞模型。所以，本研究将PCr 作用于体外培养的MC3T3-E1细胞，通过细胞学实验来研究并确认PCr 对MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化等方面的影响。

在细胞的生命活动中，细胞增殖与细胞分化是两个重要的方面。在成骨细胞增殖期间，成骨细胞不断增殖，细胞数量出现大幅度增加，为最终成骨细胞矿化做准备。本研究中采用MTT 法检测MC3T3-E1细胞增殖情况。结果显示：浓度为5、10 和20 mmol·L-1的PCr 可促进MC3T3-E1细胞的增殖。在增殖晚期，成骨细胞的生长速度减慢，细胞开始进入分化期。在分化阶段，成骨细胞可通过合成与分泌各种物质来参与骨代谢，如：ALP、BMP-2、OCN、Runx-2 等。其中，ALP 是成骨分化的一个早期特异性指标[19-20]。它是一种能将底物去磷酸化的酶，可分解体内细胞和组织中的有机磷，调节磷酸盐(Pi)和焦磷酸盐(PPi)的比率，调节羟磷灰石的形成，为最终骨组织的矿化提供条件。ALP 的活性可在成骨细胞分化过程中代表细胞分化的水平。BMP-2是目前所知的诱导和促进成骨细胞分化能力最强的物质之一，可增加ALP、OCN 和Runx-2 等骨标志物的表达，与之一起诱导成骨细胞的分化[21-23]。成骨细胞进入分化晚期时，细胞开始矿化，形成矿化结节。矿化结节的形成是成骨细胞分化成熟的晚期标志，标志着进入具有成骨功能阶段[24]。因此，在本研究中，用碱性磷酸酶(ALP)活性分析试剂盒检测细胞内ALP 的活性、用Western Blot法检测ALP和BMP-2 的蛋白表达情况以及用茜素红染色法从形态学上检测MC3T3-E1细胞矿化的能力，评价PCr 对成骨细胞的成骨分化与矿化的影响。结果显示：PCr 可以升高MC3T3-E1细胞的ALP的活性和蛋白表达、BMP-2的蛋白表达以及增加矿化结节数，即PCr 具有促进MC3T3-E1细胞成骨分化与矿化的作用。

综上所述，本研究发现PCr 具有促进MC3T3-E1细胞增殖、分化与矿化的能力，表明PCr 能够促进成骨，这预示PCr 在将来有可能成为一种预防骨质疏松和促进骨折愈合的药物而用于临床。本研究只是对PCr 在促进成骨方面的初步探究，若要解释其促成骨的具体相关作用机制，还需要进行大量深入研究。