核磁共振技术解析阿伐他汀钙的分子结构

梁向晖, 钟伟强, 毛秋平

(华南理工大学 化学与化工学院, 广东省功能分子工程重点实验室, 广东 广州 510640)

1 阿伐他汀钙简介

阿伐他汀钙(atorvastatin calcium)为1996年经美国FDA批准上市的HMG-CoA还原酶抑制剂, 是新一代的高效降血脂药[1-2]。该药不仅能降低胆固醇, 而且能降低甘油三酯, 其作用远远优于其他他汀类药物, 具有广阔的市场前景。阿伐他汀钙本身无活性,口服吸收后的水解产物在体内竞争性地抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶,使胆固醇的合成减少,也使低密度脂蛋白受体合成增加,主要作用部位在肝脏,结果使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低,中度降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平[3-4]。由此对动脉粥样硬化和冠心病的防治产生作用。

有关阿伐他汀钙的应用研究已有报道[5-8],但是利用液体核磁技术对其核磁共振(NMR)信号归属还未见完整报道。核磁共振技术是解析有机化合物结构的重要手段之一,该技术具有高灵敏度、对样品破坏较小及可原位检测等优点[9-10]。二维核磁共振技术对于解析有机化合物结构来说是一个有力的工具,广泛应用于检测药物分子化学组成、结构及其与生物分子的相互作用[11-14]。利用核磁共振氢谱(1H NMR)、氢-氢相关谱(1H-1H COSY)、核磁共振碳谱(13C NMR)、DEPT谱、异核单量子相关谱(HSQC)、异核多键相关谱(HMBC)对阿伐他汀钙的氢谱和碳谱进行全归属解析,更进一步掌握阿伐他汀钙的分子结构,为阿伐他汀钙的质量研究提供较为全面的参考依据。

阿伐他汀钙结构式如下:

图1 阿伐他汀钙结构式

2 实验

2.1 仪器

1H NMR、1H-1H COSY、13C NMR、DEPT、19F NMR、HSQC和HMBC谱均用Bruker AV 400MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)测定,核磁共振谱仪装备有5 mm BBFO宽带探头和控温单元(VTU),实验控制温度为296 K。样品溶于MeOD-d4,1H NMR 和13C NMR 的工作频率分别为400.13 MHz和100.62 MHz,1H 90°脉冲宽度为14.55 μs,13C 90°脉冲宽度为9.61 μs,二维谱采用正检测探头进行反向模式检测。

2.2 试剂

氘代试剂MeOD-d4(美国CIL公司)；阿伐他汀钙(atorvastatin calcium )原料由华南农业大学周琢强课题组提供,经HPLC测试纯度大于99%。

3 结果与讨论

3.1 1H NMR和1H-1H COSY

该化合物的1H NMR谱图见图2,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4) ：δ9.21(s,—NH),7.29(d,J=7.8Hz, 2 H), 7.22～7.16(m, 4H),7.13(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.05(t,J=7.2 Hz, 2H),7.03～6.98(m, 4H),4.67(s,—OH, 1H),4.07(m, 2H),3.98～3.84(m, 2H),3.67(m, 1H),3.35(m,J=6.6 Hz, 1H),2.34(d,J=13.9 Hz, 1H),2.23(m, 1H),1.67(m, 2H),1.52(m, 1H),1.47(d,J=6.6, 6H),1.35(m, 1H)。

积分共得到34个氢,其中化学位移δ=9.21为单峰,处于低场并且积分面积较小,归属为酰胺的氢,应有1个H。δ=1.47的峰为双重峰,积分面积为6个H,判断应该属于异丙基C-26和C-27的2个甲基的氢,结合1H-1H COSY(见图3)，δ=1.47/δ=3.35交叉峰的出现,可以归属出δ=3.35的七重峰的氢为H-25。δ=4.67为单峰,积分面积为1个H,判断应该属于羟基的氢,从碳氢一键相关中亦可看出该峰无碳氢一键相关。从碳氢远程相关谱中可看出C-1与δ=2.24,2.33存在远程相关,从而可以判断该峰为H-2；1H-1H COSY中,H-2与δ=4.06有交叉峰,从而说明δ=4.06为H-3(该峰面积积分为2,为H-3和H-6重叠所致)；H-3与δ=1.67有交叉峰,说明δ=1.67为亚甲基峰H-4；H-4与δ=3.91,3.67有交叉峰,其中δ=3.67为H-5,由于受羟基吸电子作用影响,其化学位移处于较低场；δ=3.91为H-6中的一个氢信号；H-5、H-6分别与δ=1.59存在交叉峰,说明δ=1.59为H-7。δ为6.98～7.29为芳香区的氢,积分面积为14,从氢谱谱图裂分及积分可以看出存在对位取代或单取代基的多个苯环结构,苯环中质子的归属见后面的分析,具体的1H NMR和1H-1H COSY数据及归属见表1(δH为H的化学位移)。

图2 阿伐他汀钙1H NMR谱图

图 3 阿伐他汀钙1H-1H COSY 谱图表1 阿伐他汀钙1H NMR和1H-1H COSY数据

碳位置δH耦合常数氢个数1H-1H COSY9.21sNH/217.29d,J = 7.8 Hz2H/10,157.24～7.15m4H/167.13d,J = 7.8 Hz2H/227.05t,J = 7.2 Hz2H/11,17,237.03～6.96m4H/4.67s,—OH2H/3/74.06m2HH-2,H-4/H-6

表1(续)

3.2 13C NMR、DEPT135、HSQC和HMBC

根据13C NMR谱图(见图4)。13C NMR(100 MHz, Methanol-d4)δ=182.15, 169.09, 163.66(d,JCF=246.10 Hz), 139.67,139.37, 136.23, 134.62(d,3JCF=7.65 Hz), 130.94, 130.10(d,4JCF=2.25 Hz),129.62,129.56,128.89,126.93,125.10,123.30,121.46,117.97,116.36(d,2JCF=21.59 Hz),69.21,69.18,44.92,43.78,42.18,40.61,27.53,22.83,22.81。一共有27种碳,羰基碳2种,芳基区16种,烷基区9种(其中2个峰重叠比较严重,不易区分,在DEPT135中观察得比较清晰)。

图4 阿伐他汀钙13C NMR谱图

在DEPT135谱图(见图5)中,季碳不出峰,CH、CH3的碳峰是正向的,而CH2的碳峰是负向的。由此可知,芳香区有10种季碳,8种CH碳。离氟原子近的碳在碳谱中会裂分,其偶合常数(JCF)随着键的增加而减小,谱图中δ为163.66(d,JCF=246.10 Hz)、134.62(d,3JCF=7.65 Hz)、130.10(d,4JCF=2.25 Hz)、116.36(d,2JCF=21.59 Hz)位置的峰型是分裂的,分别是连接氟原子的碳,邻位和间位和对位的碳。δ=163.66 的两重峰归属为C-12,由于受F原子的强电子诱导作用,在所有芳环最低场,δ=116.36的两重峰归属为C-11,受其邻位碳上F原子取代基推电子共轭作用,化学位移处在较高场,δ=134.62的两重峰归属为C-10,受其间位碳上F原子取代基吸电子共轭作用,化学位移处在较低场。δ=130.10的两重峰归属为C-9与阿托伐他汀内酯中相应碳的化学位移和偶合常数都接近[4,14]。δ为130.94、129.56、128.89和121.46处的谱峰峰高较强,为另外2个苯环上四类同等碳的峰。δ为121.46峰在HMBC 谱中与NH(δ=9.21)有远程偶合,NH(δ=9.21)与δ为169.10、139.67有交叉峰,归属为C-19 和C-20,C-21受其邻位C-19的酰胺取代基的推电子共轭作用,处于较为高场。在HSQC谱中,可相应归属得到H-21(δ=7.29),δ=128.89 峰在HMBC谱中与H-21存在远程偶合,可归属为C-22。C-1(δ=182.15)与δ为4.06、2.33、2.24存在远程相关,可相应归属得到H-3,H-2。H-2(δ2.33,2.24)与δ为69.18、43.78有远程相关,可以相应归属得到C-3,C-4。从HSQC谱图中,可以看到C-4与δ为1.59、1.34存在碳氢一键相关,HMBC谱图中H-4与C-3(δ=69.18),C-5(δ=69.21)存在远程相关。C-5与H-7(δ为4.06，3.91)、H-6(δ=1.66)存在远程相关,结合HSQC谱图可归属得到C-7(δ=42.17),H-7(δ为4.06，3.91)与δ为129.62、139.37存在远程相关,从而可以归属得到C-8,C-24。δ为22.83、22.81与δ=3.35存在远程相关,可相应归属得到C-26,C-27,H-25。H-25(δ=3.35)与δ为117.97、139.37有远程相关,可相应归属得到C-18,C-24。

图5 阿伐他汀钙DEPT135谱图

HSQC谱图和HMBC谱图分别见图6和图7，具体的13C NMR、DEPT、HSQC、HMBC数据及归属见表2(δc为C的化学位移，13CNMR结果)。

图6 阿伐他汀钙HSQC谱图

图7 阿伐他汀钙HMBC谱图表2 阿伐他汀钙13C NMR、DEPT135、HSQC和HMBC数据

表2(续)

4 结语

核磁共振波谱仪引入现代化学分析技术实验课程,将有机化学、有机波谱解析和仪器分析3门主要课程联系起来,有利于学生将核磁共振知识融会贯通,有助于高校“三创”型人才的培养,有利于提高学生实验操作技能,有利于激发学生探索科学的积极性,并为学生以后走上工作岗位奠定基础[15]。通过1H NMR、1H-1H COSY、13C NMR、19F NMR、DEPT135、HSQC、HMBC等手段,对阿伐他汀钙的结构进行了全面分析,明确归属了其所有的碳、氢信号峰。实验测试完样品数据后,传授学生使用谱图分析软件Topspin2.1,在告知化合物分子式的情况下,要求学生利用软件对该化合物数据进行全归属。通过本次教学实践,使研究生及化学创新班学生加深了对核磁共振二维技术的认识,同时学会利用多种工具(查阅相关文献、资料、书籍等)进行数据分析,学生的谱图解析能力得到了有力地提升。