胶质母细胞瘤中IMP3、CD164的表达及临床意义

吴景　王婧婧　李晓洁

[摘要] 目的 探討恶性肿瘤相关基因IMP3、唾液酸黏蛋白CD164在胶质母细胞瘤（GBM）组织中的表达及临床意义。 方法 收集2011年1月～2015年7月安徽省立医院119例GBM石蜡包埋样本，进行全自动免疫组化检测IMP3、CD164的表达，并与临床病理因素以及患者的生存情况进行统计学分析。 结果 IMP3、CD164的高表达率分别为69.7%（83/119）、81.5%（97/119），二者表达水平呈正相关（r = 0.252，P = 0.006）。在与临床资料关系的分析中，IMP3表达与表皮生长因子受体（EGFR）呈正相关（r = 0.242，P = 0.008），与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、Ki67增殖指数均无显著相关性（P > 0.05）。CD164表达与患者年龄（r = 0.285，P = 0.002）、EGFR（r = 0.249，P = 0.006）呈正相关，与其他不相关（P > 0.05）。CD164高表达者总生存期（OS）明显短于低表达者（P = 0.004），单独分析IMP3与OS无显著相关性（P = 0.056）。年龄、CD164是GBM的独立预后因素（P = 0.036、0.005）。 结论 GBM中CD164的表达与IMP3关系密切，CD164可作为预测GBM预后不良的独立因素。

[关键词] 胶质母细胞瘤；IMP3；CD164；总生存期

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0004-05

Expression and clinical significance of IMP3 and CD164 in glioblastomas

WU Jing1，2 WANG Jingjing2 LI Xiaojie2 HE Jie2，3

1.College of Basic Medicine， Xinxiang Medical University， He'nan Province， Xinxiang 453000， China； 2.Pathology Department， Anhui Provincial Cancer Hospital， Anhui Province， Hefei 230001， China； 3.Pathology Department， Anhui Provincial Hospital， Anhui Province， Hefei 230001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of the oncogene IMP3 and sialomucin CD164 in glioblastoma （GBM） tissues. Methods One hundred and nineteen GBM paraffin-embedded samples from January 2011 to July 2015 in Anhui Provincial Hospital were collected. The expression of IMP3 and CD164 was detected by automated immunohistochemistry. The results were analyzed with clinical and pathological factors and the survival of patients. Results The high expression rates of IMP3 and CD164 were 69.7% （83/119） and 81.5% （97/119） respectively. There was a positive correlation between the two expression levels （r = 0.252， P = 0.006）. In the connected analysis with clinical data， the expression of IMP3 was positively correlated with EGFR state （r = 0.242， P = 0.008）， and was not significantly related to the gender， age， tumor size， tumor location and Ki67 proliferation index （P > 0.05）. CD164 expression was positively correlated with age （r = 0.285，P = 0.002） and EGFR （r = 0.249，P = 0.006）， not other factors （P > 0.05）. The overall survival （OS） of patients with CD164 high expression were significantly shorter than those with low expression （P = 0.004）. There was no significant correlation between IMP3 and OS alone （P = 0.056）. Age and CD164 were independent prognostic factors of GBM （P = 0.036， 0.005）. Conclusion The expression of CD164 in GBM is closely related to IMP3， and CD164 can be used as an independent predictor of poor prognosis of GBM.

[Key words] Glioblastoma； IMP3； CD164； Overall survival

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人颅内恶性程度最高的原发性肿瘤，其浸润性生长能力强，常侵犯邻近脑组织，手术无法全部切除。术前病史短（半数以上<3个月），病程进展迅速，术后即使辅以放疗和化疗，复发间隔期也很少超过1年，中位生存期约15个月[1]。为更深入地认识GBM的临床生物学行为以指导临床预后，并寻求新的靶向治疗分子而需要展开更充分的研究。

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）介导的基因表达转录控制对于确定肿瘤细胞命运至关重要，是癌症发生的主要决定因素之一。胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3（insulin-like growth factor-Ⅱ mRNA-binding protein 3，IMP3，又称IGF2BP3），最初在胰腺癌组织中高水平表达而被鉴定，后逐渐发现在许多癌症中被重新合成并显著上调，大量文献报道IMP3参与多种组织细胞的增殖、黏附及迁移，被认为与肿瘤整体预后差有关[2]。CD164糖蛋白（the cluster of differentiation 164，CD164，又称MGC-24/endolyn）是唾液酸黏蛋白家族的成员。研究发现，CD164涉及人类多种恶性肿瘤的维持和进展[3-6]，然而CD164在GBM中的研究甚少报道。CD164与GBM肿瘤生物学行为的关系，仍未可知。本研究利用全自动免疫组化法检测IMP3和CD164在119例GBM组织中的表达，分析其与临床病理特征及预后的关系，结合文献探讨其在GBM中的生物学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年1月～2015年7月安徽省立医院病理科存档的GBM石蜡组织标本119例（男79例，女40例，中位年龄55岁）及因脑血管畸形手术切除的非瘤脑组织20例。所有组织均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋。所有患者术前均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗。GBM标本的入选依据世界卫生组织（2016）中枢神经系统胶质瘤分类标准[7]，由两位病理医师经双盲法重新复诊切片。采用电话联系方式进行定期随访，随访截止日期是2017年8月31日。随访内容包括：①一般情况；②是否复发及复发后是否继续治疗；③是否存活，若死亡，具体死亡原因及时间。从患者第1次手术到GBM死亡日期或随访截止日期的时间间隔计为总生存期（OS）。全部患者的OS为22～1987 d，平均463 d，中位生存期372 d。本研究中使用的组织标本经医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

一抗：兔抗人多克隆抗体IMP3及CD164（工作浓度分别为1∶50和1∶100）购自北京博奥森生物技术公司；二抗试剂盒及脱蜡液、抗原修復液、清洗缓冲液均购自Ventana公司；蒸馏水、无水乙醇、二甲苯、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、中性树胶均为国产试剂。

1.3 实验方法

采用全自动免疫组化检测。石蜡包埋样本3 μm厚度连续切片，60℃恒温箱烤片2 h，Ventana Bench Maker XT全自动免疫组化仪进行染色。用已知阳性对照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

由两位病理医师对染色结果进行判读。IMP3染色定位于细胞质，CD164定位于细胞核。每张切片选取10个高倍视野，以最高得分纳入统计。评分标准包括：按比例评分（每个高倍视野计数100个肿瘤细胞中阳性细胞所占比例）：≤10%，计1分；>10%～50%，计2分；>50%～75%，计3分；>75%，计4分。按染色强度评分：无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计0、1、2、3分。将两项分值相加得到最终得分：0～3分为低表达，4～7分为高表达。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料以例数或百分比表示，不同组间差异性比较采用χ2检验及Fisher精确检验法。相关性分析采用Spearman相关分析。采用Kaplan-Meier法估计生存曲线，并使用Log-rank检验比较生存曲线是否有差异。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素预后分析，并计算风险比（HR）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IMP3、CD164在GBM组织中的表达

IMP3免疫组化染色定位于肿瘤细胞胞质，CD164染色定位于肿瘤细胞核。见图1（封三）。119例GBM组织中，IMP3的高表达率为69.7%（83/119），CD164的高表达率为81.5%（97/119），IMP3和CD164均高表达的比率为61.3%（73/119），两者的表达呈正相关（P = 0.006）。见表1。20例因脑血管畸形手术切除的非瘤脑组织中，IMP3和CD164均不染色或局灶微弱染色，高表达率均为0（0/20）。

2.2 IMP3、CD164与GBM临床病理因素的相关性

为阐明GBM中IMP3和CD164的临床意义，分析119例GBM组织中IMP3、CD164的表达与患者临床病理因素的相关性。见表2。结果显示IMP3与EGFR呈正相关（r = 0.242，P = 0.008），与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、Ki67增殖指数均无明显相关性（P > 0.05）。CD164表达与患者年龄（r = 0.285， P = 0.002）、表皮生长因子受体（EGFR）（r = 0.249，P = 0.006）呈正相关，与其他指标无明显相关性（P > 0.05）。

2.3 IMP3及CD164表达与GBM预后的关系

为进一步确定IMP3和CD164与预后的关系，采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析119例GBM患者IMP3、CD164表达水平与OS的关系。分析结果显示IMP3与GBM患者OS无明显相关性（P = 0.056）； CD164高表达患者，OS明显短于CD164低表达者（P = 0.004）。见图2。

2.4 GBM生存

對OS有显著影响的因素为患者年龄（P = 0.038）、CD164（P = 0.005），而患者性别、肿瘤直径、肿瘤部位、EGFR、Ki67及IMP3表达情况对患者OS均无显著影响。将单因素分析差异有统计学意义的因素以及可能的影响因素IMP3纳入多因素Cox回归模型中，发现患者年龄（P = 0.036）、CD164（P = 0.005）是GBM预后的独立危险因素。见表3。

3 讨论

GBM的侵袭性、高复发率及普遍耐药性是其预后不良的主要原因，与胶质母细胞瘤干细胞样细胞（glioblastoma stem-like cells，GSC）的生物特性有关。GSC是GBM亚群，以高迁移潜能和治疗耐药性而著称[8]，对GBM的生长、放化疗的敏感性和肿瘤复发的可能性具有重要作用[9]。研究证明CD164参与调节造血干细胞和祖细胞的增殖、黏附和迁移，并维持祖细胞的未分化状态[10]，且增加人脐血CD133+细胞迁移[11]，而CD133+也是GSC特异性分子标志物。另据报道，CD164过表达显著增加肺上皮细胞的致瘤性及干细胞性质，促进肿瘤生长和增强药物抵抗性[12]。我们检测CD164在GBM组织中高水平表达，因而猜测CD164可能与GSC的自我更新、迁移及耐药机制相关，从而导致GBM的不良预后。

另外，CD164已被证明参与多种实体癌症的增殖和侵袭，包括肺癌、卵巢癌、结肠癌和前列腺癌。Huang等[4]评估了CD164在97例患者卵巢表面上皮细胞中的作用，发现高表达CD164与高级别卵巢肿瘤、晚期疾病和肿瘤转移显著相关。他们提出通过基质细胞衍生因子1α/趋化因子受体4型（SDF-1α/CXCR4）轴参与卵巢癌进展，CD164表达增加，促进肿瘤发生。CD164在人卵巢上皮细胞中的过表达促进了细胞增殖和抑制凋亡，并在小鼠异种移植模型中证实了CD164的致瘤性效应。Tang等[5]揭示在人结肠癌细胞系中CD164表达的降低显著抑制了细胞增殖，迁移和转移。Havens等[6]分析了CD164在前列腺癌细胞系中的作用，阻断CD164削弱了前列腺癌细胞黏附到骨髓内皮细胞并侵入细胞外基质的能力。此外，最近报道，在胶质瘤细胞系U87的研究中发现，CD164 mRNA和蛋白质水平均显著增加，敲低CD164抑制U87细胞增殖并促进凋亡[13]。这些研究表明CD164可能作为调节肿瘤进展的关键分子。虽然CD164的具体作用机制还不清楚，本研究中CD164作为GBM预后不良的独立因子，提示CD164与GBM的进展密切相关。

IMP3是进化上保守的mRNA结合蛋白家族的成员，其调节mRNA转运、翻译和转化。越来越多的研究证实，RBP在调节RNA剪接、稳定性、定位、修饰和翻译中的作用[14]。IMP3是一种肿瘤胚胎性RBP，与肿瘤迁移、侵袭、血管生成、癌症干细胞样细胞（cancer stem-like cells，CSCs）维持有关，并与肿瘤恶性程度和复发性有关[15-16]。已报道IMP3在多种人类恶性肿瘤中过表达，包括卵巢癌[17]、结直肠癌[18]、头颈部鳞状细胞癌[19]、肺癌[20]、食管癌[21]、胃癌[22]等。一项对8877个人类癌症组织的微阵列研究结果显示，IMP3表达是大多数人类实体癌类型的共同特征[23]。另一项关于肿瘤预后的荟萃分析显示，IMP3高表达与大多数实体瘤预后不良有关[24]。最新的研究，在胶质瘤中，IMP3与p65（转录因子NF-κB的异二聚体亚基）mRNA的3′非编码区（UTR）结合并增强其翻译，促进胶质瘤细胞迁移[25]。IMP3作为一种RBP，可以和多种目标mRNA结合[26]。在这里，笔者发现GBM中IMP3与CD164具有显著相关性，笔者怀疑在GBM中，IMP3除了和p65 mRNA结合以外，有可能同时与CD164的mRNA结合，在翻译层面的调控促进GBM的肿瘤进展。

总结本研究，IMP3和CD164在GBM组织中高表达，且CD164与GBM患者OS显著相关，CD164可作为GBM预后不良的预测因素。此外，CD164与IMP3表达显著正相关，提示GBM中CD164的表达与IMP3密切相关，推测可能由IMP3作为转录后的调控因子，介导了CD164在GBM中的表达。然而，这只是一个初步现象学研究，并没有具体的分子机制的研究，需要进一步探索在GBM中IMP3与CD164转录物的相互作用。

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（收稿日期：2018-02-02 本文編辑：张瑜杰）