利用CRISPR/Cas9 技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系

尹丽阳，罗世锋，陈 宇，漆轲婧，彭 云，万永奇，吴秀山，李永青

(湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，教育部重点实验室，生命科学学院心脏发育研究中心，湖南 长沙410081)

生物信息学分析显示ASB11蛋白在N-末端有6个串联重复的锚蛋白结构域和1个在C-末端的SOCS箱形结构域[1]。ASB11蛋白是调控Delta-Notch信号的元件，以一种细胞非自主性机制调节DeltaA与Notch之间的侧抑制，是Delta-Notch信号至关重要的调节因子[2]。近年来有研究表明，Asb11在斑马鱼胚胎发育的终端分化过程中表达下调，且对于外胚层谱系分布范围具有潜在的调节作用，并表明Asb11的表达是肌肉祖细胞扩增所必须的，而其表达下调标志着终端分化的开始[3,4]。随后也有证据表明，Asb11是胚胎发育和成体肌肉再生的主要调节者[5]。

本实验室前期研究发现，Asb11基因包含的两个2.9 kb和5.0 kb转录本在心肌和骨骼肌中特异性表达[6]；前人研究表明斑马鱼Asb11基因与Notch信号通路的激活有关，而Notch信号通路与斑马鱼心脏的瓣膜及流出道的发育有关。因此，本文作者推测Asb11基因也是一种与心脏发育相关的候选基因，其对于心脏的发育可能有重要的调节作用，且其可能通过Notch信号途径调控心脏的发育。

作为近年来兴起的基因编辑技术，CRISPR/Cas9是细菌演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗外来入侵的病毒及DNA[7-9]。前人研究中将CRISPR/Cas9分为3种类型，其中Ⅱ型中的Cas9能够识别一种非编码RNA(sgRNA)，从而对靶向dsDNA序列进行定点切割[10]。因此，本文利用CRISPR/Cas9打靶技术对斑马鱼Asb11基因进行基因敲除。首先经网站分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点，通过PCR扩增出用于转录Asb11基因的CRISPR/Cas9打靶gRNA的双链DNA模板，再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA都转录出来，混合后共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。在显微注射后，对Asb11基因CRISPR/Cas9打靶的F0代进行有效性检测，发现在斑马鱼Asb11基因的第一号外显子出现了5个和8个碱基的缺失，证明CRISPR/Cas9 系统对Asb11基因的敲除是有效的。进一步对其F0代、F1代和F2代进行筛选，成功获得Asb11基因敲除的斑马鱼品系。这些工作为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌感受态菌株E.coli：Top10 以及DH5α，克隆T载体(PMD18-T)，本实验所有的野生型斑马鱼AB品系(所获得胚胎均在28.5 ℃恒温E3水中进行孵育)，DNA胶纯化和回收试剂盒，T7转录试剂盒，质粒快速提取试剂盒，显微注射仪，RNA Cycle Pure kit等。

1.2 方法

1.2.1 Crispr打靶位点的选择

从Esembl(http:// www.ensembl.org / index.html)网站上获取目标基因的完整序列，各个转录本以及外显子和内含子等信息；并选取其中序列大小合适的外显子(一般优先选取1号外显子)，再在NCBI(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/)网站上Blast其序列是否单一正确。然后用网上软件( http://www.genome-engineering.org / crispr/? page_id=41)进行打靶位点的设计选择，从中选取评分最高、最合适的靶标位点。

1.2.2 靶标序列gRNA的合成

根据国家斑马鱼资中心的资料可知，科学家已将 gRNA 的骨架序列克隆至PMD19-T 载体中，并命名为 p42250 质粒(如图1所示)。运用1.2.1所述网站设计合成的gRNA以P42250质粒(gRNA骨架载体)为模板进行PCR扩增，将扩增后得到的序列进行PCR产物胶纯化回收，用T7转录酶系统对纯化回收后的PCR序列进行体外转录成mRNA，再用RNA纯化试剂盒对mRNA纯化回收，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 Cas9的合成与制备

用XbaⅠ将mRNA Cas9的模板h-Cas9质粒酶切线性化，经过DNA胶纯化回收试剂盒进行纯化回收，用RNase Free H2O 溶解回收于RNase Free 的EP管中。使用T7 Ultra Kit (Ambion，AM1345) 进行体外转录成mRNA，再用RNA纯化试剂盒对mRNA纯化回收，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 斑马鱼胚胎显微注射及有效性检测

收取斑马鱼胚胎，待其发育至Ⅰ细胞期时排列整齐于注射板上，用半自动注射仪将提前混合好的hCas9 mRNA和gRNA(二者的混合按一定的浓度比：hCas9 mRNA∶300 ng/μL，gRNA∶20 ng/μL；)共同注射其中。同时收取同缸产的野生型胚胎进行对照，置于28 ℃培养箱培养48 h至72 h，期间收取1/3注射过后的胚胎及WT的胚胎进行有效性检测，提取其基因组，然后进行PCR扩增，测序检测。

1.2.5 斑马鱼F0、F1、F2代基因型鉴定

胚胎有效性检测为阳性后，将该批斑马鱼培养至3个月左右成熟，对单个个体斑马鱼剪尾提取基因组，PCR后测序分析，对于测序结果为双峰的个体，进行PMD18-T载体连接转化，再进行测序分析，从而获得有缺失的突变个体即F0代。将F0代与WT杂交，获得F1代，剪尾提取基因组DNA，进行PCR，产物进行测序分析，获得可稳定遗传的F1代。F1代雄性杂合体与F1代雌性杂合体杂交，可获得F2代纯合突变体，然后进行PCR和测序检测分析。

图1 p42250质粒示意图Fig.1 The picture of p42250 plasmid

图2 Asb11基因靶标位点示意图Fig.2 The design diagram of Asb11 gene targeting site注: 以上序列是 Asb11基因序列的一部分，加粗部分是 1 号外显子;未加粗的是内含子;下划线为直线的表示靶标序列;下划线为双直线的表示 PAM 序列;阴影部分为检测引物，绿色为两对引物重叠部分。Note:The above sequence is a partial sequence of the Asb11 gene;the bold part is exon 1;the un-enhanced portion is an intron;“ ”: the target sequence;“ ” : the PAM sequence;shadow region: the primers for detection;green region: the overlap of two pairs primers.

2 结果

2.1 Asb11基因靶位点的选择

按1.2.1所述的方法在Asb11基因1号外显子上择优选取打靶位点，将保护碱基 tg 和 T7 启动子加在设计好的靶位点序列前面，gRNA骨架的上游序列加在靶位点后面，将此作为正向引物序列，命名为：Asb11-gRNA-F1；以gRNA骨架的下游序列为反向引物，即Asb11-Cas-R (如表1) 。

2.2 Asb11基因gRNA和CAS9 mRNA的合成

将按1.2.2中所述方法设计好的靶标gRNA序列送铂尚公司合成后，用XbaⅠ酶切线性化的p42250质粒为模板，以Asb11-gRNA-F1为正向引物，Asb11-Cas-R作为反向引物进行PCR扩增(凝胶电泳结果如图3)。将PCR产物纯化回收后，以T7体外转录系统进行体外转录成mRNA，随后纯化回收(图4所示)；hCas9 mRNA也是以线性化的p42250质粒为模板体外转录获得，纯化回收后均 保存于-80 ℃。

表1 gRNA及引物序列列表Tab.1 gRNA and primers list

注: 其中 Asb11-gRNA-F1是gRNA 正向引物;tg是保护碱基;TAATACGACTCACTATA 是T7启动子序列;下划线部分是靶标序列;GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 是gRNA 骨架上游序列;Asb11-Cas-R是gRNA反向引物;AAGCACCGACTCGGTGCCACT 是gRNA 骨架下游序列；Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS，Asb11-F2-S和Asb11-F2-AS是检测引物。
Note: Asb11-gRNA-F1: gRNA forward primer;Tg: the protecting base;TAATACGACTCACTATA: the T7 promoter sequence;“ ”: the target site sequence;GTTTTAGAGCTA GAAATAGC: the upstream sequence of the gRNA backbone sequence;Asb11-Cas-R: a gRNA reverse primer;AAGCACCGACTCGGTGCCACT: the downstream sequence of the gRNA back-bone sequence;Asb11-Exon1-S, Asb11-Exon1-AS, Asb11-F2-S, Asb11-F2-AS: the primers for detection.

图3 Asb11基因gRNA 模板PCR扩增片段结果Fig.3 The PCR amplification results of Asb11-gRNAM:DNA marker;1、2:Asb11-gRNA-F1

图4 Asb11基因gRNA体外转录纯化结果Fig.4 The transcriptional purification results of Asb11-gRNAM:DNA marker;1、2:Asb11-gRNA-F1

2.3 Asb11基因打靶有效性检测分析

由1.2.4所述的实验方法将hCas9mRNA与Asb11-gRNA-F1在斑马鱼胚胎发育至Ⅰ细胞期时混合共同注射入胚胎中，将胚胎置于28 ℃下孵育48-72 h后随机挑取8管，其中1管为野生型胚胎(对照)，每管大约5-10颗胚胎提取基因组，以其为模板，分别以Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS为正反引物进行PCR扩增，凝胶电泳结果显示PCR产物的大小约为400 bp(图5所示)，与预期的387 bp相符。将PCR产物送测序分析，结果显示在Asb11-gRNA-F1的靶位点处出现双峰(结果如图6)，提示该位点存在碱基的插入与缺失。

为了更明确Asb11-gRNA-F1注射的有效性，我们将注射的胚胎提基因组后纯化回收PCR 产物与PMD18-T载体连接后转化，挑10个左右单克隆菌落送测序，测序结果表明确实存在5 bp和8 bp碱基的缺失(如图7)。进一步说明了Asb11-gRNA-F1注射是有效的。

2.4 Asb11基因打靶F0代突变体的筛选

检测过打靶的有效性后，将注射了Asb11-gRNA-F1与hCas9的胚胎培养至3个月左右性成熟，养大的斑马鱼一共有21条，按编号Asb11-F0-1至Asb11-F0-21对其进行排序剪尾提基因组，并以其为模板，用引物Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS进行PCR扩增，得到一条387 bp的条带，回收PCR产物送测序，测序结果显示Asb11-F0-3、5、8、9靶位点有双峰，打靶效率为19.04%，其中Asb11-F0-8的测序结果如图8所示。

图5 PCR产物电泳结果示意图Fig.5 The electrophoresis results of PCR productM:DNA marker;1-7:注射组1-7; 8:WT (野生型对照组)M:DNA marker;1-7:Injection group 1-7;8:WT (control group)

图6 PCR 产物测序峰值图Fig.6 PCR product sequencing peak results注：图为正向测序峰值结果，黑色下划线部分为Asb11-gRNA-F1靶标位点。Note:The picture is the result of forward direction sequencing peak map;“ ”: the target sequence of Asb11-gRNA-F1.

图7 gRNA打靶区域序列与正常序列比对结果Fig.7 The BLAST comparison results of gRNA target sequence to the sequence of WT 注：黑色下划线部分为Asb11-gRNA-F1靶标位点，黑色下划线为三直线部分表示PAM序列Note:“ ”:the target sequence of Asb11-gRNA-F1;“ ”: the PAM sequence.

图8 Asb11-F0-8 的 PCR产物测序峰值结果图Fig．8 Asb11-F0-8 PCR product sequencing peak results注：黑色下划线部分为Asb11-gRNA-F1靶标位点。Note:“ ”: the target sequence of Asb11-gRNA-F1.

通过对测序结果进行分析，我们将Asb11-F0-3、5、8、9这4个基因组PCR的纯化产物与PMD18-T载体连接，之后转化挑10个单克隆菌落送测序，并对测序结果进行比对，获知Asb11-F0-9、3、5、8分别出现1个和2个碱基的插入，9个和14个碱基的缺失(如图9)，由于9是3的倍数，因此Asb11-F0-5的敲除未达到目的。

2.5 稳定性遗传的检测

为了验证F0代个体是否能够稳定遗传，我们将F0代嵌合体与野生型斑马鱼杂交得到F1代个体，培养至3个月左右性成熟，对F1代个体剪尾提基因组，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，送测序；将测序结果为双峰的PCR产物纯化回收后连接PMD18-T载体克隆，挑单克隆测序比对分析结果见表2，结果显示有3个突变类型能够稳定遗传。

图9 Asb11 F0代测序比对结果示意图Fig.9 The blast of sequence results of Asb11 F0

表2 斑马鱼Asb11基因F1代突变体比对结果图Tab.2 The blast results of zebrafish Asb11 gene mutant F1

注：Query：WT序列； Sbjct：测序序列。
Note:Query: WT sequence;Sbjct:Sequencing sequence.

2.6 F2代纯合突变体的筛选

本文选择缺失了14个碱基的Asb11-F1-1，插入了1个和2个碱基的Asb11-F1-2、Asb11-F1-3这3种F1代突变体建立稳定遗传的纯合敲除品系。已经筛选到缺失了14个碱基的雄性和雌性F1代斑马鱼突变体，二者杂交后获得大量胚胎，在适宜条件下培养胚胎至3个月左右性成熟，剪尾提取基因组鉴定。通过两对检测引物进行PCR扩增后的电泳结果及测序检测分析(图10所示)，已经获得F2代雄性纯合突变体。Asb11-F2-S和Asb11-F2-ASPCR扩增的条带大小为181 bp，在Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS为引物进行PCR扩增有大小为387 bp的条带的情况下,若第二对引物PCR扩增无条带，则表明为纯合子(如图11)。

图10 PCR产物电泳结果Fig.10 The electrophoresis results of PCR product M:DNA marker;1-15:F2代个体;8: WT (野生型对照组)M:DNA marker;1-15:F2 generation fish; 8: WT (control group)

图11 F2代纯合突变体测序比对结果Fig.11 The blast of sequence results of homozygous F2 generation mutant

目前已对152条F2代进行了突变体的筛选，得到了24条纯合突变体，均为雄性，尚未获得雌性纯合突变体。还有大量F2代小鱼及胚胎正在培育中，将继续筛查。

3 讨论

CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN、ES 细胞打靶和 TALEN 打靶等传统技术后出现的第四种可应用于定点构建基因敲除大、小鼠动物模型的方法。它设计简单，制作成本低；效率高、速度快；能特异性识别任意序列，无物种限制；毒性低且脱靶情况少，因而广泛应用于基因定点修饰，在动物模型构建的应用上前景十分广阔，目前已广泛应用于生命科学领域的研究[11-17]。本文用CRISPR/Cas9基因编辑技术，也在斑马鱼胚胎的整体水平敲除了Asb11基因，成功地构建斑马鱼Asb11基因敲除稳定遗传系。

本实验室的前期研究结果显示Asb11基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。Asb11基因在骨骼肌中的作用已经得到了很好的诠释。已有的研究表明Asb11的表达是肌肉祖细胞扩增所必须的，而其表达下调标志终末分化的开始[3,4]，该基因还是成体肌肉再生的主要调节者[5]。但是Asb11基因在心脏发育中的功能尚不清楚。为此，本文用CRISPR/Cas9基因编辑的新技术构建斑马鱼Asb11基因敲除品系，通过PCR测序检测分析已经成功获得了可以稳定遗传的F2代突变体系。这一工作为深入探究该基因在心脏发育中的作用奠定了基础。

在对F2代突变体的筛选中，本次研究仅获得了该基因缺失14 bp的雄性纯合突变体，并未筛选到雌性纯合突变体。斑马鱼早期是雌雄同体，卵巢的发育是受精后10-20 d期间，随后卵巢细胞开始凋亡，精巢开始发育，其性别分化被确定[18]。斑马鱼的性成熟需要3个月左右，在其胚胎发育阶段，存在多个决定其性腺发育的基因；有研究显示，斑马鱼的性别决定也是由多个基因协同调控芳香化酶基因的表达，使其活性降低或缺失，从而影响雌激素的分泌，导致卵巢的程序性死亡；而在这种情况下，睾丸细胞开始分化，斑马鱼的性别逐渐由雌性向雄性转变[19,20]。对于本次研究中F2代纯合突变体仅出现雄性的现象，较为合理的解释有四种：1)实验样本基数过少。本研究已完成性别鉴定的斑马鱼152条，但纯合子突变体只有24条，实验基数还不够大，须在后期的研究中增大F2代个体筛选的数目，以完全排除筛选基数少导致这种现象的可能性。2)在斑马鱼的养殖过程中，本文作者发现斑马鱼的养殖密度过大也可能会影响到其性别的分化,使得斑马鱼的性别由雌性向雄性转化。后期需减小F2代斑马鱼个体的养殖密度，应按照合理的饲养密度不大于1Tail/L进行F2代斑马鱼的饲养，排除养殖密度对性别分化的影响。3)众所周知，CRISPR/Cas9打靶技术仍然存在一定的脱靶率，所以在Asb11基因被敲除的情况下，也可能出现其他与斑马鱼性别决定相关的基因被敲除。因此，需对斑马鱼性别决定的相关基因进行鉴定、筛查或者进行全基因组测序，确定其他基因是否发生了移码突变，从而影响了其性别的分化。4)Asb11基因可能参与了斑马鱼的性别发育，且在性别转化过程中该基因是不可或缺的，即在斑马鱼性别分化过程中Asb11基因发挥着关键作用，正常表达的Asb11基因会保持斑马鱼性别转化的稳定性，使后代雌雄比例保持相对稳定的状态。一旦Asb11基因缺失，斑马鱼的性别分化机制可能发生紊乱，这种紊乱可能为斑马鱼雌性发育过程被阻断，促使斑马鱼在性别分化过程中只能向雄性转化。也可能为Asb11基因敲除后，启动了卵巢细胞的凋亡机制，加速了卵巢细胞的凋亡进程，在此过程中精巢细胞发育过程不受影响，使得Asb11基因敲除后的F2代纯合突变体均为雄性。只有确定F2代纯合突变体的性别决定是否受其他因素的影响，才能进行进一步有关Asb11基因是否是斑马鱼性别决定相关基因的具体情况分析研究。