三角枫天然四倍体变异的鉴定

安 凯，丰 震，乔 谦，任红剑

（山东农业大学林学院，山东 泰安271018）

三角枫（Acer buergerianum Miq.）为槭树科槭树属落叶乔木，是我国自然分布的优良乡土槭树。三角枫适应性强，耐干旱瘠薄，也耐一定的水湿，且稍耐荫，根萌性强，我国种植范围极广；另外，三角枫是一种材质好、用途广的速生阔叶林木，其木材坚实、纹理直、刨面光泽、色纹美观，具有重要的经济价值[1]。三角枫也是重要的色叶树种和森林风景林资源[2]。当前国内关于三角枫的研究较少，主要多集中在园林应用方面，尤其是在育种方面国内研究较少[3]。多倍体作为培育新品种的重要亲本材料，对于三角枫多倍体的发现在种质资源方面具有重要意义。

流式细胞仪能够定量测定某一细胞中DNA、RNA含量，在植物育种方面，可以快速准确鉴定植物倍性，相比染色体计数和组型分析等传统方法，流式细胞仪检测不受植物取材部位和时期限制[4-7]，更加简单方便，同时精度更高。

多倍化是植物进化变异的一种自然现象，也是植物育种的重要手段[8]。多倍体植物常表现出茎粗、叶大、叶厚、抗性强等特点，尤其在生长速度、遗传品质、抗逆性等方面具有显著优势。多倍体产生后可以增加遗传进化的多样性，也可以为新品种的培育和研究提供重要材料。多倍体鉴定的方法主要有形态学鉴定、生理生化指标鉴定、细胞学鉴定、流式细胞仪鉴定和染色体计数等，各种鉴定方法经常综合应用，相互印证[9-14]。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料三角枫实生苗、三角枫1号无性系、2号无性系均取自山东农业大学林学院园林实训基地的槭属资源圃。三角枫1号无性系和2号无性系是课题组选育的三角枫新品系，其选育方法为：在三角枫的1年生播种育苗群体中，发现两株生长较快的超级苗，以普通三角枫实生苗为砧木，通过嫁接繁殖培育成了三角枫1号无性系和2号无性系。

1.2 试验方法

1.2.1 流式细胞仪鉴定

取三角枫实生苗、1号无性系、2号无性系正常叶片，洗净去除中脉后称取叶片20mg置于培养皿中，加入新鲜裂解液①（配方见表1）200uL，再向样品中加入裂解液②600uL，用双城刀片将叶片切碎，处理3～5min。吸取1mL切好的样品经300木尼龙网过滤到1.5mL离心管中，加入1mg/mL碘化丙啶溶液，使碘化丙啶溶液最终浓度为0.1mg/mL，处理5min，随即上机检测。仪器使用加拿大Handyem公司HPC-150个人型流式细胞仪。每个测试样品设置三个重复，每次最少收集9000个细胞。

表1 裂解液配方

1.2.2 形态学及气孔扫描电子显微观察

外观形态对比：按照槭属DUS测试指南分别测量两种三角枫叶片长度、叶片宽度、叶面积、叶柄长度、叶柄宽度、叶片厚度、叶裂角度、树高、胸径。

气孔扫描电子显微观察：取新鲜叶片，室温下至于氯仿中进行脱蜡处理，用磷酸缓冲液冲洗干净，用刀片切成10mm×10mm大小，在4℃戊二醛固定液中过夜，用磷酸缓冲液多次冲洗；在50%、70%、85%、95%、100%乙醇中梯度脱水后干燥，放入样品杯，镀膜后在扫描电镜下观察拍照。取10个视野测气孔长度和宽度，计算各指标平均值，并统计气孔密度。

1.2.3 石蜡切片制作

取新鲜叶片，在FAA固定液中固定24小时，充分用水冲洗，除去遗留在组织内的固定液及结晶沉淀；将叶片切成小块，使用85%、95%、100%乙醇进行彻底脱水；脱水完成后用二甲苯进行透明处理，以替换出植物组织内的酒精；然后进行浸蜡、包埋处理；将处理好的材料切片，切片厚度控制在8μm～20μm之内；用粘片剂将蜡片牢附在载玻片上，之后进行脱蜡并使用番红和固绿进行染色；最后将切片固封。在显微镜下观察拍照。

1.2.4 数据处理

使用Excel和SPSS 22软件进行进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 流式细胞仪结果分析

三角枫1号无性系叶片单细胞DNA含量的峰值在2e5处左右，分布如图1所示，二倍体三角枫与2号无性系峰值在1e5左右。由此我们可以看出，三角枫1号无性系叶片单细胞DNA含量是二倍体的2倍，2号无性系与二倍体叶片单细胞DNA含量相同。

2.2 扫描电镜观察

图1 叶片DNA含量比较

三角枫1号无性系和2号无性系气孔比较如图2所示。从表2中可以看出，三角枫1号无性系气孔长95.42μm、宽53.27μm明显大于2号无性系长 68.89μm 和宽 31.79μm，差异显著（图 2-C,2-D）。由图2-A、2-B可以明显看到三角枫1号无性系气孔密度小于2号无性系；经计算三角枫1号无性系单位面积气孔数51.15个，显著低于2号无性系单位面积气孔数。三角枫1号无性系叶下表皮细胞明显大于2号无性系，且更凸起。三角枫1号、2号在电镜观察前均使用氯仿进行除蜡处理，三角枫1号仍残存较多蜡质，2号表面蜡质完全脱掉；从图2-A、2-C中可以清楚观察到三角枫1号无性系叶片下表皮蜡质层的存在，表层蜡质膜被有机溶剂严重侵蚀，布满丝状网纹，梯度脱水所用的酒精等溶剂也可以溶解叶片表皮的蜡质成分[15]。

2.3 形态学对比

三角枫1号无性系枝干挺拔，小枝细瘦，当年生枝条绿色。三角枫2号无性系，枝干扭曲（图2-E,2-F）。两者的叶片形态学对照比较结果如表3所示（图2-G,2-H）。三角枫1号无性系在叶片长度、叶片宽度、叶片厚度、叶柄粗细均大于2号无性系和三角枫实生苗，叶柄长度2号与三角枫实生苗差别较小，略长于1号。其中叶片长度、叶片宽度、叶柄粗细、树高、胸径差异显著。

2.4 叶片解剖结构比较

比较两种三角枫无性系的叶片解剖结构（图2-I,2-J），三角枫1号无性系上表皮细胞排列规则，栅栏组织较厚；栅栏组织和海绵组织排列紧密，角质层较厚。三角枫2号无性系栅栏组织较薄且排列无规则，海绵组织排列松散，角质层较薄。下表皮细胞和保卫细胞三角枫1号无性系明显大于2号无性系。

3 讨论与结论

自然发生多倍体在植物界中普遍存在，是植物进化的重要途径之一。植物中被认可度较高的多倍体形成机制主要是体细胞加倍和配子不减数两类。多倍体在发展农作物新品种中有很大作用，如无籽西瓜、良种小黑麦等，都体现了多倍体的优良特性。多倍体育种在林业中也具有巨大潜力，但是目前培育成的品种还较少。通过多倍体育种可以得到生长速度快、品质优良的品种，大大缩短培育时间，提高自身价值。本次试验所用材料三角枫1号无性系为自然变异，相比人工诱导，自然多倍体经过长时间的适应和选择，在长势和抗逆性方面优于人工诱导多倍体，更具有利用价值[16]。

多倍体的形态和生理效应，在很大程度上有赖于原来二倍体基因型的性质。相对二倍体来说，多倍体在在植物形态上都有所改变，生长量增加、叶面积增大、叶片厚度变厚、气孔变大、气孔密度减小等。多倍体由于体细胞的增大，细胞表面积相应缩小，在生理特性方面也常常与二倍体不同；多倍体常表现出含水量较多，渗透压低，代谢强度较低，生育期较长。但是个别器官和整株的最后大小，不仅受细胞原有大小的影响，还受细胞伸长长度和细胞数目的影响。多倍体对细胞的伸长和细胞的分裂都可能不产生影响，植物的多倍体其染色体增加的倍数存在一定的范围，超出此范围，植物的生长可能会受到染色体的增多而受到抑制，还可能由于染色体的极度增加而引起核力学上的困难和其它的不平衡，最终形成障碍[17]。因此，单从形态学参数上来确定是否是多倍体，存在较大误差，还需要进一步进行倍性鉴定。Zhang X Y对紫薇的研究中，从形态学角度鉴定为多倍体的植物，通过流式细胞仪检测，只有50%为多倍体。同时在人工诱导多倍体的形成中，存在着大量的嵌合体。在相同脱蜡处理下，三角枫1号叶片残存大量破损蜡质层，2号叶片表面蜡质完全脱掉，因此我们推测蜡质残留可能与两种无性系间抗逆性或蜡质层成分有关，这需要深入的研究进行验证。

表2 叶片气孔特征比较

表3 形态学比较

图2 三角枫无性系气孔及形态特征比较

本试验通过流式细胞仪检测，三角枫1号无性系叶片单细胞DNA含量是二倍体的两倍，2号无性系叶片单细胞DNA含量与二倍体相同；三角枫1号无性系的气孔长度比2号无性系大38.51%，气孔密度比2号无性系小33.57%；三角枫1号无性系在胸径、树高、叶厚、叶片大小、保卫细胞大小等方面均显著大于2号无性系。因此，三角枫1号无性系是四倍体，三角枫2号无性系是二倍体。