下调AFAP-1L2表达对人胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响

刘 博，戚 诚*，赵 爽，赵晓东，刘学臣，张立超，石 畅

0 引言

胰腺癌恶性度高，早期发现困难，预后差，生存期短，化疗敏感性差[1]。胰腺癌手术治疗后治愈率也极低，转移率高。对靶基因的筛选并寻找治疗靶点，是胰腺癌治疗的主要方向，也是可能延长生存期的治疗手段[2]。吉西他滨(Gemcitabine，Gem)是一种细胞周期特异性的抗代谢化疗药，在DNA合成期(S期)杀灭肿瘤细胞，将癌细胞自G1期向S期的进展阻断[3]。AFAP-1L2 (Actin filament-associated protein 1-like 2，XB130)是一种接头蛋白，与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及转移等恶性生物学行为相关[4]。本课题组前期研究发现，在胰腺癌细胞AFAP-1L2在mRNA、蛋白水平高表达，促进胰腺癌细胞增殖，抑制凋亡[5-6]。本研究采用siRNA (小干扰RNA)下调胰腺癌细胞株中AFAP-1L2表达，并给予吉西他滨化疗干预，旨在观察AFAP-1L2基因下调对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响，为胰腺癌治疗靶点的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞MiaPaCa-2购自中科院上海细胞库，以1640培养基行贴壁细胞培养、传代。AFAP-1L2山羊多克隆抗体(sc-138089)购自美国Santa Cruz公司。DAB显色试剂盒购自美国SIGMA公司，BCA定量及ECL发光试剂盒均购自南京凯基生物公司。逆转录及扩增试剂盒、TRIzol(日本Takara公司)。LipofectamineTM2000、miRNA提取分离试剂盒、TRIzol、RPIM1640(大连宝生生物技术有限公司)。引物在北京生工生物工程有限公司设计及合成。MTT试剂盒(美国Invitrogen 公司)，All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒(美国GeneCopoeia公司)。siAFAP-1L2及siNegative Control质粒由美国Addgene公司设计合成。

1.2 研究方法

1.2.1 实时定量PCR (qRT-PCR)法 依据RNA分离试剂盒及Trizol试剂说明书规定步骤进行细胞RNA提取并纯化，按照逆转录及扩增试剂盒说明书步骤逆转录及扩增。取样品的RNA给予纯度和完整性测定，符合纯度高、不存在蛋白质及DNA污染、总RNA抽取条件的完整细胞行PCR。各组细胞的cDNA为模板，设3个复孔，反应体系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl，45×Syber Green 2 μl，Primer F 1 μl，Primer R 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 4 μl。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s；75 ℃ 30 s(共45个循环)，采用ΔΔCT法进行不同组别基因差异表达的比较。

1.2.2 siAFAP-1L2及siNegative Control转染MiaPaCa-2细胞 试验分组：转染siAFAP-1L2的siAFAP-1L2组，转染siNegative Control的siNegative control组。按照LipofectamineTM2000说明书步骤对对数期生长且24 h内融合达75%～95%的MisPaCa-2细胞进行转染，转染48 h后，应用Western blot、qRT-PCR法对AFAP-1L2蛋白、mRNA水平的转染效率进行检测，转染效率约75%。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(Methyl-thiazolyl-tetrazolium，MTT) 取对数期生长MiaPaCa-2细胞制备单细胞悬液，依照MTT试剂盒说明，将细胞以1×104/孔密度接种于96孔的细胞培养板内，并设立3个复孔，常规细胞培养步骤进行培养，每孔内加5 mg/ml的MTT液 5 μl，在37 ℃条件下继续温育4 h，弃上清，每孔DMSO液150 μl，进行水平振荡将结晶溶解，以酶联免疫检测法测定各孔的吸光度，重复3次试验取平均值，绘制生长曲线。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将转染后传代的细胞转移到EP管消化，按Annexin V/PI试剂盒操作说明进行凋亡检测，取对数生长期的MiaPaCa-2细胞，以EDTA胰酶进行消化，采用 4 ℃预冷的PBS进行2次洗涤，离心条件为4 ℃下，300 r/min，重悬细胞，将浓度调整为1×106/ml。将100 μl细胞悬液加入流式管，添加Annexin V-FITC (5 μl)、PI (10 μl)，在避光、室温条件下反应15 min，然后加入400 μl PBS，混匀后1 h内，样品置于流式细胞仪进行检测。记录早期凋亡百分率，实验重复3次。

2 结果

2.1 siAFAP-1L2转染对胰腺癌细胞MiaPaCa-2增殖的影响 分别以不同浓度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)的siAFAP-1L2转染胰腺癌细胞48 h后，与siNegative control组比较，12.5、25、50、100、200 nmol/L转染siAFAP-1L2组细胞存活率较低，差异有统计学意义(P<0.05)；在培养24、48、72、96 h后，MiaPaCa-2细胞与siNegative control组比较，转染siAFAP-1L2组细胞在48 h后存活率较低，差异有统计学意义(P<0.05)；siAFAP-1L2转染后细胞存活率与siAFAP-1L2转染浓度和时间具有相关性(r=-0.921，r=-0.907)。见图1。下调AFAP-1L2表达降低胰腺癌细胞的存活率，并具有剂量、时间依赖性。

2.2 siAFAP-1L2转染对胰腺癌细胞化疗药Gem敏感性的影响 将化疗药Gem 20 nmol/L加入分别以不同浓度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)siAFAP-1L2转染的胰腺癌细胞，48 h后，与siNegative control组比较，25、50、100、200 nmol/L各转染siAFAP-1L2组细胞存活率较低，差异有统计学意义(P<0.05)；将化疗药Gem 20 nmol/L加入siAFAP-1L2 100 nmol/L转染的胰腺癌MiaPaCa-2细胞，培养24、48、72、96 h后，与siNegative control组比较，Gem对各浓度转染siAFAP-1L2组细胞在72、96 h后存活率较低，差异有统计学意义(P<0.05)；siAFAP-1L2转染后在Gem化疗细胞存活率与siAFAP-1L2转染浓度和时间具有相关性(r=-0.967，r=-0.984)。见图2。下调siAFAP-1L2表达可以增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，并具有时间依赖性及剂量依赖性。

2.3 siAFAP-1L2转染及化疗药Gem对MiaPaCa-2细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡显示，siAFAP-1L2+Gem组、siAFAP-1L2组的凋亡率分别为37.28%、11.65%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。siAFAP-1L2可以增强吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤作用。

3 讨论

胰腺癌是恶性度最高的消化系统恶性肿瘤之一，其1年生存率低于25%，而5年生存率更是低于5%。确诊时80%以上患者已经发生远处转移[7]。近年以手术为基础的放疗、化疗等综合治疗手段没有显著提高胰腺癌的生存期及降低病死率[8]。作为细胞周期特异性抗代谢抗癌药，吉西他滨作用于肿瘤细胞的S期，阻止细胞从G1期向S期进展，在胰腺癌化疗中具有良好的疗效，一定程度上提高了患者的生存期，但是化疗的总体疗效仍然非常有限[9]。化疗附加靶向治疗已经成为肿瘤治疗的主要综合治疗方式[10]。本研究对AFAP-1L2表达进行下调，观察其对胰腺癌细胞的作用及其对吉西他滨化疗是否具有增效作用。

图1 MTT检测不同浓度梯度及培养不同时间MiaPaCa-2细胞存活率

图2 MTT检测Gem干预下不同浓度梯度及培养不同时间MiaPaCa-2细胞存活率

本研究显示，siAFAP-1L2转染后，胰腺癌细胞存活率与siAFAP-1L2转染浓度和时间具有相关性，浓度越高或作用时间越长，胰腺癌细胞存活率越低。下调AFAP-1L2表达降低胰腺癌细胞的存活率，并具有剂量及时间依赖性。本课题组前期研究显示，AFAP-1L2在胰腺导管腺癌组织中高表达，预示胰腺癌预后不良，是胰腺癌的预后独立预测因素[5-6]。AFAP-1L2作用于下游PI3K/Akt信号通路，通过α-Akt磷酸化对PI3K/Akt通路活性进行调控，下调AFAP-1L2表达后阻断了PI3K/Akt信号通路，从而降低了胰腺癌细胞的存活率。本研究进一步显示，siAFAP-1L2转染后，在Gem化疗细胞存活率与siAFAP-1L2转染浓度和时间存在相关性。下调siAFAP-1L2表达可以增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，并具有时间、剂量依赖性。siAFAP-1L2促进吉西他滨干预胰腺癌细胞的凋亡，增强吉西他滨对胰腺癌细胞的杀灭作用，下调AFAP-1L2表达可以使吉西他滨化疗增效。前期对AFVAP-1L2作用机制的研究也显示，AFAP-1L2下调减弱了MiaPaCa-2细胞增殖能力，停留在G1期细胞增多，在G2、S期比例减少，凋亡增加[5-6]。对AFAP-1L2表达进行干扰，可降低胰腺癌细胞的增殖能力，并使其停留在G1期细胞增多，凋亡率升高，PI3K/Akt信号通路受到抑制，磷酸化α-Akt减少，从而起到对胰腺癌细胞的杀灭作用。Shiozaki等[11]研究显示，AFAP-1L2通过调控下游信号通路PI3K/Akt，促进α-Akt磷酸化，该通路对下游酪氨酸及色氨酸残基进一步磷酸化，从而调控细胞周期、增殖及侵袭等行为。Zheng等[12]研究认为，抑制PI3K/Akt信号通路后，增殖及凋亡等胰腺癌细胞的活性减弱，同时增加肿瘤细胞对厄洛替尼化疗敏感性。

综上所述，下调AFAP-1L2表达可增强胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性，促进对胰腺癌细胞的杀伤作用，AFAP-1L2可作为胰腺癌治疗靶向候选基因。