猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测中包被抗原的研究

娄亚坤，任宝红，张 杰，曾小宇，付燕峰，赵林萍

（郑州中道生物技术有限公司，河南郑州450000）

0 引言

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Syndrome Virus，PRRSV）引起的急性、高度传染性疾病，俗称“蓝耳病”。PRRS现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，其中高致病性蓝耳病属于农业部规定的“一类动物疫病”，已经严重威胁养猪业健康发展。PRRSV为不分节段单股正链RNA，含有至少8个不分首尾重叠的开放阅读框，分别编码8种蛋白即：多聚蛋白 ppla、pplab，小囊膜蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4，囊膜蛋白 GP5，膜基质蛋白 M和核衣壳蛋白 N［1］。

目前市场上，检测PRRSV抗体多以核衣壳蛋白N、膜基质蛋白等单一蛋白包被［2-5］。这就可能存在着样品漏检，感染初期检测准确率不高，病毒变异导致敏感性下降等缺陷。鉴于此，以N蛋白、M蛋白、GP5蛋白为单包或混包抗原，研究了最佳包被条件，建立初步的诊断方法，为PRRSV抗体ELISA检测试剂盒进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

猪繁殖与呼吸综合征疫苗（CH-1R株）抗原：哈尔滨维科生物技术开发公司；pET-28a（+）Plasmid：武汉淼灵生物科技有限公司；感受态细胞 BL21（DE3）、Trizol、PCR SuperMix、逆转录酶TransScript Reverse Transcriptase、T4连接酶：北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒：Axygen公司；限制性内切酶、DNA Marker：TaKara公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白、M蛋白、GP5蛋白、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG：洛阳佰奥通实验材料中心；20份猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性标准血清及20份阴性标准血清由郑州中道生物技术有限公司制备。

2 方法

2.1 PRRSV ELISA抗体检测方法研究

2.1.1 抗原性蛋白单独包被的最佳浓度与血清稀释倍数的确定

采用方阵滴定法分别确定PRRSV N蛋白、M蛋白、GP5蛋白包被浓度和待检血清的稀释度。将N蛋白、M蛋白、GP5蛋白分别按 2.5 ng／孔、5 ng／孔、10 ng／孔、20 ng／孔的浓度倍比稀释后进行包被，标准阴性血清及标准阳性血清按1∶5，1∶10，1∶20倍比稀释，方阵滴定，进行常规ELISA测定，选择阳性血清与阴性血清 OD450 nm比值（P／N）值最大，且阴性血清OD450 nm较小的抗原浓度和血清稀释度，从而确定单包最佳条件。

2.1.2 临界值判断标准确定

根据方阵试验结果，分别用N蛋白、M蛋白、GP5蛋白以最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释倍数，常规ELISA方法检测PRRSV抗体阴性的血清20份N1～N20。记录OD450 nm值，并计算平均值（X）及标准偏差（SD），根据统计学3σ准则，阴阳的临界值为X+3SD。即OD450 nm≥X+3SD时，即为阳性。计算N蛋白、M蛋白、GP5蛋白的临界值。

2.1.3 混合包被的条件选择

2.1.3.1 抗原性蛋白单独包被研究

用选定的N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最适包被浓度分别包被抗原，常规ELISA方法，分别测定经病毒中和试验确证的20份PRRSV抗体阳性标准血清样本P1～P20，5份阴性标准血清样本N1～N5，根据阴阳血清的临界值，比较各血清样本P／N值及阳性检出率。

2.1.3.2 抗原性蛋白混合包被研究

根据单独包被试验数据结果，将N蛋白作为主要包被蛋白，以N、M、GP5 3个蛋白的最佳包被浓度，分别按 1∶0.5∶0.5、1∶0.5∶1、1∶0.5∶1.5、1∶1∶0.5、1∶1∶1、1∶1∶1.5、1∶1.5∶0.5、1∶1.5∶1、1∶1.5∶1.5比例混合，分别作为包被抗原进行包被，并制作包被板，检测20份PRRSV抗体阳性血清样本P1～P20，20份阴性血清样本N1～N20，以N蛋白、M蛋白、GP5蛋白的最大临界值判定，并比较各血清样本检出率，确定最佳包被抗原比例。

3 结果

3.1 抗原性蛋白的最佳包被浓度与血清稀释倍数方阵滴定

试验结果表明，N蛋白的最佳包被浓度为以5ng／孔，PRRSV抗体阴阳性血清样本1∶10稀释；M蛋白最佳包被浓度为5ng／孔，PRRSV抗体阴阳性血清样本1∶10稀释；GP5蛋白最佳包被浓度为10ng／孔的浓度进行包被，PRRSV抗体阴阳性血清样本1∶10稀释。

3.2 临界值判断标准确定

根据方阵试验结果，N蛋白、M蛋白、GP5蛋白分别以最佳包被条件及最佳血清稀释倍数，常规ELISA方法检测20份PRRSV阴性血清。根据统计学原理，计算N蛋白临界值为0.194，M蛋白临界值为 0.161，GP5蛋白临界值为 0.199。

3.3 N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最适条件测定结果

3.3.1 3种抗原性蛋白单独包被结果

从表1可知，3种蛋白单独包被反应板，测定的阳性血清样本及阴性血清样本均出现漏检情况，但漏检样本有互补。且其中N蛋白的P／N值最高且阳性检出率最高（85.0%）。因此，以N蛋白为主包被蛋白，试验尝试采用3种蛋白混合包被，研究最佳包被条件，以降低漏检率。

表1 3种蛋白单独包被测定结果 %

3.3.2 N蛋白、M蛋白、GP5蛋白不同浓度混合包被测定阴、阳性血清样本结果

由N蛋白、M蛋白、GP5蛋白单独包被的试验结果表明，N蛋白的最佳包被浓度为5 ng／孔，M蛋白的最佳包被浓度是5 ng／孔，GP5蛋白的最佳包被浓度为10 ng／孔；血清的最佳稀释比例均为1∶10；以N蛋白为主包被蛋白，N、M、GP5 3种抗原性蛋白以各自的最佳包被浓度，按照不同的比例包被，由试验结果可知，当N、M、GP5蛋白以单包最佳包被量比例为1∶1∶0.5时，即N蛋白、M蛋白、GP5蛋白包被量均为5ng／孔，阳性检出率为100%，且阴性样品假阳性检出率为0。因此，N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最佳的混包量均为5 ng∶5 ng∶5 ng／孔。

4 讨论

N蛋白是PRRSV所有蛋白中表达量较高的蛋白，至少含有5个抗原表位，具有很强的免疫原性，因此N蛋白进行病毒特异性抗体的检测和疾病的诊断的靶抗原［6］。本研究中，以N蛋白单包的ELISA检查阳性率最高（85.0%），因此以N蛋白为主包被蛋白。

M蛋白是PRRSV所有结构蛋白中稳定性最强的一个，是最重要和最保守的结构蛋白。GP5蛋白具有高度变异性，具有中和表位，是重要的免疫区域。

因此，本研究中以N蛋白为主包被蛋白，M蛋白、GP5蛋白为辅助蛋白混合包被，研究出了最佳包被浓度即N蛋白、M蛋白、GP5蛋白混包量均为5 ng∶5 ng∶5 ng／孔时，敏感性、特异性均为100%，有效避免了单独包被抗原性蛋白出现的灵敏度低，漏检或错检的问题。

综上所述，制备的检测试剂可初步用于临床PRRSV血清抗体的检测，为今后PRRSV抗体ELISA检测试剂的进一步研制奠定了基础。